Kombination von bioorthogonaler Fluoreszenzmarkierung mit künstlichen Aminosäuren und neuronalen Netzen sowie Partikelmittelung zur verbesserten hochaufgelösten Bildgebung

• Antragsteller: Professor Dr. Philip Kollmannsberger; Professor Dr. Markus Sauer
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Analytische Chemie ; Bioinformatik und Theoretische Biologie ; Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 440773101

• Erstellungsjahr: 2025

Zusammenfassung der Projektergebnisse

In den letzten Jahren hat sich die superhochauflösende Mikroskopie als leistungsfähige Methode für die Fluoreszenzbildgebung von Zellen und Geweben etabliert. Mit der weiteren Verbesserung der räumlichen Auflösung, z. B. in Kombination mit Expansionsmikroskopie, sind sowohl die Größe als auch die Dichte der Fluoreszenzmarker zu den wichtigsten limitierenden Faktoren für die superhochauflösende Mikroskopie geworden. In diesem Projekt sind wir beide Herausforderungen mit einer Kombination aus experimentellen und computergestützten Ansätzen angegangen. Der Schwerpunkt des experimentellen Teils des Projekts lag auf der Verringerung der Größe von Fluoreszenzsonden durch neuartige Markierungsstrategien, die auf der Verwendung unnatürlicher Aminosäuren beruhen, und deren Kombination mit optimierten Ansätzen der superhochauflösenden Mikroskopie. Wir haben die genetische Code-Expansion (GCE) als vielseitigen Ansatz entwickelt, um unnatürliche Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubringen, gefolgt von einer Klick-Markierung mit Tetrazin-Farbstoffen mit minimalem Verknüpfungsfehler. Auf diese Weise konnten wir sowohl tetramerische GluK2-Rezeptoren als auch trimere PCNA-Proteine stöchiometrisch markieren und zeigen, dass Abstände von weniger als 10 nm zwischen den Klickstellen durch DNA-PAINT und Expansionsmikroskopie räumlich aufgelöst werden können. Der computergestützte Teil des Projekts befasste sich mit der Erhöhung der effektiven Auflösung bei niedriger Markierungsdichte unter Verwendung von Deep Learning. In der ersten Phase entwickelten wir einen neuen Algorithmus, der auf Fourier- Ring-Korrelation und anisotroper Kerneldichte-Schätzung basiert, um die Rekonstruktion von Mikrotubuli zu verbessern. Dann haben wir uns daran gemacht, die erste Phase der Rekonstruktion, die Lokalisation der Emitter, zu verbessern, indem wir Deep Learning mit Compressed Sensing kombinierten und den Suchkontext auf die zeitliche Dimension ausdehnten. Schließlich haben wir neuartige Ansätze zur Partikelmittelung entwickelt, die auf geometrischem Deep Learning basieren. Alle drei Methoden sind für die Öffentlichkeit zugänglich und ermöglichen die Kartierung von subzellulären Strukturen aus Expansionsmikroskopiedaten mit geringer Dichte und bisher unerreichter Auflösung.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications, 12(1).
  Bessa-Neto, Diogo; Beliu, Gerti; Kuhlemann, Alexander; Pecoraro, Valeria; Doose, Sören; Retailleau, Natacha; Chevrier, Nicolas; Perrais, David; Sauer, Markus & Choquet, Daniel
  
• Fourier Ring Correlation and Anisotropic Kernel Density Estimation Improve Deep Learning Based SMLM Reconstruction of Microtubules. Frontiers in Bioinformatics, 1.
  Berberich, Andreas; Kurz, Andreas; Reinhard, Sebastian; Paul, Torsten Johann; Burd, Paul Ray; Sauer, Markus & Kollmannsberger, Philip
  
• Photoblueing of organic dyes can cause artifacts in super-resolution microscopy. Nature Methods, 18(3), 253-257.
  Helmerich, Dominic A.; Beliu, Gerti; Matikonda, Siddharth S.; Schnermann, Martin J. & Sauer, Markus
  
• Super-resolving Microscopy in Neuroscience. Chemical Reviews, 121(19), 11971-12015.
  Werner, Christian; Sauer, Markus & Geis, Christian
  
• Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10-nm resolution barrier. Nature Methods, 19(8), 986-994.
  Helmerich, Dominic A.; Beliu, Gerti; Taban, Danush; Meub, Mara; Streit, Marcel; Kuhlemann, Alexander; Doose, Sören & Sauer, Markus
  
• ReCSAI: recursive compressed sensing artificial intelligence for confocal lifetime localization microscopy. BMC Bioinformatics, 23(1).
  Reinhard, Sebastian; Helmerich, Dominic A.; Boras, Dominik; Sauer, Markus & Kollmannsberger, Philip
  
• Coronaviruses Use ACE2 Monomers as Entry‐Receptors. Angewandte Chemie International Edition, 62(30).
  Eiring, Patrick; Klein, Teresa; Backes, Simone; Streit, Marcel; Jungblut, Marvin; Doose, Sören; Beliu, Gerti & Sauer, Markus
  
• PCNA as Protein‐Based Nanoruler for Sub‐10 nm Fluorescence Imaging. Advanced Materials, 36(7).
  Helmerich, Dominic A.; Budiarta, Made; Taban, Danush; Doose, Sören; Beliu, Gerti & Sauer, Markus
  
• Improving single molecule localisation microscopy reconstruction by extending the temporal context. openRxiv.
  Reinhard, Sebastian; Ebert, Vincent; Schrama, Jann; Sauer, Markus & Kollmannsberger, Philip