Untersuchung der intrazellulären thermodynamischen und funktionellen Eigenschaften eines nukleotidbindenden Proteins durch hochaufgelöste Fluor-NMR-Spektroskopie

• Antragsteller: Professor Dr. Michael Kovermann
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 441495846

Die hochauflösende NMR-Spektroskopie ist in der Lage, mit einer Vielzahl an Methoden strukturelle, dynamische und funktionelle Eigenschaften von Proteinen zu erhalten. Dabei wird die Mehrzahl der durchgeführten Studien in verdünnten Lösungen durchgeführt („in vitro“), die nicht die natürliche Umgebung von Proteinen in der Zelle widerspiegeln. Der vorliegende Antrag hat sich daher zum Ziel gesetzt, die thermodynamische Stabilität, die intrinsische Dynamik und die Ligandenaffinität eines Proteins sowohl im Zelllysat als auch im intrazellulären Kontext zu quantifizieren. Dazu wird vorgeschlagen, das nukleotidbindende Kälteschockprotein gezielt mit Fluor zu markieren und nachfolgend NMR-spektroskopisch durch die Detektion der Fluorresonanzsignale eingehend in seiner natürlichen Umgebung zu studieren. Durch diese Markierungsstrategie wird der hohe Hintergrund an Protonen-, Stickstoff- und Kohlenstoffresonanzsignalen effizient ausgeblendet. Darüber hinaus hat sich der vorliegende Antrag zum Ziel gesetzt, die Affinität der Protein-Ligand Interaktion im Zelllysat und im intrazellulären Kontext zu bestimmen. Zu diesem Zweck werden zweidimensionale heteronukleare NMR-Experimente vorgeschlagen, die die Korrelation sowohl zwischen Fluor (Proteinsignal) und Phosphor (Ligandsignal) als auch Fluor und Kohlenstoff (Verwendung einer isotopenmarkierten Form des Liganden) NMR-spektroskopisch aufzulösen. Da für das Kälteschockprotein eine Vielzahl von Vergleichsdaten zur Verfügung steht, die unter in vitro Bedingungen gewonnen worden sind, sollen die hier beabsichtigten Arbeiten neue Beiträge dafür liefern, wie sich die fundamentalen Eigenschaften eines Proteins wie Struktur, Dynamik und Funktion zwischen verdünnter Lösung und zellulärem Kontext unterscheiden. Die Bestimmung der intrazellulären Affinität zwischen Protein und Ligand stellt in diesem Zusammenhang eine ideale Möglichkeit dar, um mit der Anwendung mehrdimensionaler Korrelationsexperimente die Einsatzmöglichkeiten von Fluor NMR-Spektroskopie entscheidend zu erweitern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen