Identifikation von Enhancern im Pflanzengenom unter Verwendung eines in vitro Transkriptionssystems
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Generationen von Pflanzenwissenschaftlern haben sich der Untersuchung der pflanzlichen Genregulation gewidmet. Aufgrund seiner Komplexität steht die umfassende Entschlüsselung des regulatorischen Codes, der die Genexpression in Pflanzen steuert, jedoch noch aus. „Selftranscribing active regulatory region sequencing“ (STARR-seq), eine Methode zur genomweiten Identifizierung von Enhancern, hat zu großen Fortschritten im Bereich der tierischen Genregulation geführt. In Pflanzen leidet diese Methode jedoch unter einem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis und wird überdies durch die relative niedrige Transformationseffizienz vieler Pflanzenzellen erschwert. Um die durch die oft niedrige pflanzliche Transformationseffizienz verursachten Probleme zu umschiffen, plante ich STARR-seq in einem auf Pflanzenzellen basierendem in vitro Transkriptionssystem durchzuführen. Meine Versuche transkriptionsfähige Pflanzenzellextrakte mittels einer publizierten Prozedur herzustellen schlugen jedoch fehl. Stattdessen habe ich eine auf Agrobakterien beruhende Transformationsmethode für Tabakblätter etabliert, die in einem einzigen Experiment bis zu 25 Millionen transformierte Zellen liefern kann. Parallel dazu habe ich eine Variante von STARR-seq entwickelt, die für die Nutzung in Pflanzen optimiert ist. Diese „Plant STARR-seq“ Methode verfügt über ein deutlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis und einen großen Dynamikbereich. Mit Plant STARR-seq kann die umweltbedingungsspezifische Aktivität von Enhancern gemessen werden und Enhancer können mit Einzelbasenauflösung charakterisiert werden. Um die Hochdurchsatzfähigkeit von Plant STARR-seq zu demonstrieren, habe ich diese Methode zur Bestimmung der Aktivität von über 75.000 Core-Promotoren aus dem Genom von Arabidopsis, Sorghumhirse und Mais verwendet. Diese Studie legte offen in welchem Umfang Core-Promoter-Elemente—wie zum Beispiel die TATA-Box—sowie der GC-Gehalt und promotornahe Bindestellen für Transkriptionsfaktoren die Stärke von Promotoren beeinflussen. Ausgehend von diesen Ergebnissen konnte ich starke synthetische Promotoren mit einer Aktivität ähnlich der des viralen 35S Minimal-Promotors entwerfen. Des Weiteren entwickelte ich Computermodelle, welche die Stärke von Promotoren vorhersagen und zur Verbesserung von Promotoren durch in silico Evolution verwendet werden können. Die Herangehensweise, die ich in dieser Studie zu Core-Promotoren erarbeitet habe, kann auch zur Charakterisierung von zusätzlichen cis-Elementen und zur Erzeugung von synthetischen Elementen mit erstrebenswerten Eigenschaften verfolgt werden. Zukünftig werde ich als Emmy Noether Gruppenleiter an der Heinrich-Heine-Universität in Düsseldorf meine Untersuchungen der pflanzlichen Genregulation fortsetzen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Identification of Plant Enhancers and Their Constituent Elements by STARR-seq in Tobacco Leaves. The Plant Cell, 32(7), 2120-2131.
Jores, Tobias; Tonnies, Jackson; Dorrity, Michael W.; Cuperus, Josh T.; Fields, Stanley & Queitsch, Christine
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Plant genome engineering from lab to field—a Keystone Symposia report. Annals of the New York Academy of Sciences, 1506(1), 35-54.
Cable, Jennifer; Ronald, Pamela C.; Voytas, Daniel; Zhang, Feng; Levy, Avraham A.; Takatsuka, Ayumu; Arimura, Shin‐ichi; Jacobsen, Steven E.; Toki, Seiichi; Toda, Erika; Gao, Caixia; Zhu, Jian‐Kang; Boch, Jens; Van Eck, Joyce; Mahfouz, Magdy; Andersson, Mariette; Fridman, Eyal; Weiss, Trevor; Wang, Kan ... & Bagchi, Rammyani
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Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants, 7(6), 842-855.
Jores, Tobias; Tonnies, Jackson; Wrightsman, Travis; Buckler, Edward S.; Cuperus, Josh T.; Fields, Stanley & Queitsch, Christine
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EUGENe: A Python toolkit for predictive analyses of regulatory sequences.
Klie, Adam; Stites, Hayden; Jores, Tobias; Solvason, Joe J.; Farley, Emma K. & Carter, Hannah
