Gerichtete Evolution von Adenylierungs-Domänen geleitet von Hydroxamat-Profilen (DEHAMA)

• Antragsteller: Dr. Hajo Kries
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie
• Förderung: Förderung von 2020 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 441781663

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind Enzyme, die an der Herstellung vielfältiger bioaktiver Naturstoffe wie Ciclosporin, Vancomycin oder Surfactin beteiligt sind. Durch NRPS-Engineering können diese Verbindungen potenziell strukturell diversifiziert und auf bestimmte Anwendungen zugeschnitten werden. Dazu werden wir das Substratspektrum der Adenylierungsdomäne (A-) erweitern, die hauptsächlich für die Substratauswahl in NRPS verantwortlich ist. Dieser Ansatz basiert auf der Hypothese, dass promiske Enzyme in der Natur und im Labor vielseitige evolutionäre Intermediate sind. Wir werden die A-Domäne in Modul SrfA-C aus der Surfactin-Biosynthese in einem gerichteten Evolutionsexperiment mutieren und währenddessen das gesamte Substratspektrum von Hunderten von Mutanten mittels Hydroxamat-Profilierung (HAMA) verfolgen. HAMA entschlüsselt durch Massenspektrometrie, welche Hydroxamatprodukte entstehen, wenn der Quencher Hydroxylamin zu einer A-Domänen-Reaktion gegeben wird. Mit HAMA können Dutzende Substrate parallel getestet werden, was die Situation innerhalb einer Zelle widerspiegelt und in einem einzigen Experiment ein umfassendes Spezifitätsprofil einer A-Domäne aufzeichnet. Die gerichtete Evolution von SrfA-C zum hoch-promisken „SrfA-Chub“ - einem Hub, von dem viele neue Spezifitäten erreicht werden können – soll gelenkt von HAMA in mehreren aufeinanderfolgenden Mutageneserunden durchgeführt werden. Basierend auf den HAMA-Profilen der dabei erstellten Mutanten-Bibliotheken werden wir den Einfluss einzelner A-Domänenreste auf die Spezifität quantifizieren, was zukünftige Evolutionsexperimente erleichtern wird. Das evolvierte SrfA-Chub wird ein künstliches Modell eines promisken evolutionären Intermediats liefern und seine Charakterisierung zu unserem Verständnis der natürlichen NRPS-Evolution beitragen. SrfA-Chub wird auch als Vorbild dienen, um die Promiskuität in verwandten A-Domänen zu erhöhen. Um die Bildung von Surfactin-Varianten zu testen, werden wir das srfA-C-Gen im natürlichen Surfactin-Produzenten durch srfA-Chub ersetzen. Insgesamt werden diese Experimente unser Verständnis von NRPS-Engineering und Evolution verbessern und somit Grundlagen legen, um in Zukunft die maßgeschneiderte Biosynthese von lebensrettenden Peptid-Medikamenten zu ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen