Neue Polymere für Lipiddoppelschicht-Nanodiscs zur Untersuchung der molekularen Grundlagen der GPCR-Signalübertragung
Biophysik
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Unser Ziel ist es, zu verstehen, wie G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sich im Laufe der Zeit umstrukturieren, wenn sie von ihren Liganden aktiviert werden, was ihre strukturelle Dynamik betrifft. Dies ist eine spannende biologische Frage, da sowohl strukturelle Veränderungen als auch die molekulare Dynamik der GPCR-Aktivierung deren Pharmakologie bestimmen. Konkret wollen wir fluoreszenzbasierte Sensoren entwickeln, um die Bewegungen einzelner Rezeptordomänen zu verfolgen. Polymer-Nanodiscs ermöglichen es, die Rezeptoren in vitro unter strengen Bedingungen zu untersuchen, jedoch in einer Umgebung, die der natürlichen Membran nahekommt. Wir verwenden die Erweiterung des genetischen Codes, um nicht-kanonische Aminosäuren für bioorthogonale Chemie in die GPCRs einzubauen. So können wir die Rezeptoren an jeder zugänglichen Stelle mit Fluorophoren kennzeichnen, sowohl in vitro als auch auf der Oberfläche lebender Zellen. Bei dem Einbau von zwei Markierungen für FRET-Reporter entdeckten wir zufällig, dass auch ein einzelner Fluorophor an spezifischen Stellen die Emissionsintensität nach Rezeptoraktivierung verändern kann, vermutlich durch eine Änderung der lokalen Umgebung (polar/nicht-polar) um das Chromophor. Auf dieser Basis entwickelten wir einer neuen Klasse von GPCR-Biosensoren, mit denen konformationelle Umstrukturierungen auf der Ebene eines einzelnen Rests direkt auf der Oberfläche lebender Zellen verfolgt werden können. Am muskarinischen M2-Acetylcholinrezeptor, einem GPCR, der durch einen kleinen Molekül-Liganden aktiviert wird, zeigen wir, dass pharmakologisch unterschiedliche Agonisten verschiedene Rezeptorkonformationen stabilisieren. Durch die Analyse der Fluoreszenzkinetik in verschiedenen Regionen des Rezeptors belegten wir auch, dass Aktivierung nicht durch eine konzertierte Bewegung des gesamten Rezeptors erfolgt, sondern durch eine Reihe sequenzieller konformationeller Änderungen in einzelnen Domänen. Mit dem gleichen Sensortypen zeigten wir beim rhodopsin-ähnlichen GPCR Y5, der große Peptid-Liganden bindet, dass der 7-Transmembran (7TM)-Kern schneller umstrukturiert wird als der lösliche N-Terminus (NT) während der Peptidbindung. Obwohl Crosslinking-Daten zeigen, dass der NT umfangreiche Kontakte mit dem Liganden bildet, deuten die Kinetik- Daten darauf hin, dass der NT nicht für die Peptidrekrutierung verantwortlich ist, was bei secretin-ähnlichen GPCRs der Fall ist. Zudem zeigen wir, dass die Kopplung an G-Proteine nur die Kinetik des Rezeptorkerns beeinflusst und dass der Kern für die Ligandenselektivität verantwortlich ist. Insgesamt haben wir ein neues System etabliert, um konformationelle Umstrukturierungen von GPCRs zu verfolgen, ohne diese aus ihrer natürlichen zellulären Umgebung zu extrahieren. Diese Technik kann auf jeden GPCR angewendet werden. Derzeit arbeiten wir daran, die Methodologie in vitro zu übertragen und kleinere Fluorophore für präzisere Verfolgung von Rückgratbewegungen zu verwenden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Noncanonical Amino Acid Tools and Their Application to Membrane Protein Studies. Chemical Reviews, 124(22), 12498-12550.
De Faveri, Chiara; Mattheisen, Jordan M.; Sakmar, Thomas P. & Coin, Irene
