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Funktion der Phospholipasen von von Legionella pneumophila beim Austritt aus der Vakuole und dem Wirt
Antragstellerin
Professorin Dr. Antje Flieger
Fachliche Zuordnung
Medizinische Mikrobiologie und Mykologie, Hygiene, Molekulare Infektionsbiologie
Förderung
Förderung seit 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 446411117
Legionella pneumophila (Lpn) ist ein wichtiges intrazelluläres bakterielles Pathogen, das die menschliche Lunge und Umweltprotozoen infiziert. Die Bakterien replizieren in einem besonderen Phagosom, der Legionella-enthaltende Vakuole (LCV). Der Austritt von Lpn aus Wirtszellen kann zuerst die Freisetzung der Bakterien aus der LCV und folgend aus der Wirtszelle umfassen. Der Exit stellt einen bedeutenden Schritt des Infektionszyklus dar, der dem Pathogen die weitere Transmission erlaubt. Dieser ist essentiell für die Ausbreitung der Erkrankung oder die Verbreitung des Pathogens in der Umwelt. Aber die Mechanismen, die den Austritt der Bakterien aus dem Wirt herbeiführen, sind zu einem großen Teil noch ungeklärt. Insbesondere bakterielle Phospholipasen können aufgrund ihrer membranzerstörenden Aktivität den Wirtszellaustritt von Lpn fördern. Lpn besitzt eine Vielzahl solcher Enzyme zu denen 15 Phospholipasen A (PLA), drei Phospholipasen C (PLC) und eine Phospholipase D (PLD) gehören. Die PLAs und insbesondere die GDSL und PlaB Enzyme sowie die PLCs sind aufgrund ihrer Substratspezifität, hohen Aktivität, ihrer Abundanz zu späteren Zeitpunkten des bakteriellen Wachstums, ihrer sekretierten oder oberflächenassoziierten Natur besonders geeignet den bakteriellen Exit zu unterstützen. Und tatsächlich wurden damit einige bereits in Verbindung gebracht. In Projektphase II werden wir auf Ergebnissen der Phase I aufbauen, wie z.B. der erfolgten Charakterisierung von diversen Phospholipase-Aktivierungsmechanismen, der assoziierten starken membranzerstörenden Aktivitäten, der Etablierung der LCV Isolation und Lipidomics Analysen und der Identifikation von geeigneten Oberflächenproteinen für die Präsentation eines Exit Reporters auf der bakteriellen Oberfläche. Die folgenden Arbeiten sollen fortführt werden: 1) Etablierung von effizienten Methoden der Exit Quantifizierung, wie ein Betalaktamase- oder Sphingomyelin-basierter Reporter Assay, der die Freisetzung der Bakterien aus der LCV über Fluoreszenz Readout detektiert. 2) Außerdem soll die Bedeutung der Phospholipasen und deren hyperaktiven Proteinversionen für den Lpn Exit durch Analysen von definierten Lpn Mutanten bestimmt werden. 3) Es soll weiterführend untersucht werden wie die Lpn Phospholipasen den Austritt aus der LCV herbeiführen und welche Lipide kritisch für die beobachteten Phänotypen sind. Artifizielle Lipid-Bilayer Assays sollen hierbei das Potential der Phospholipasen hinsichtlich Membranpermeabilisierung analysieren. 4) Es soll ein Screen auf essentielle Lpn Exitgene unter Anwendung von Tn-seq durchgeführt werden. Schließlich werden dabei gefundene Mutanten hinsichtlich ihres Grades und der Qualität des Exitdefektes, ihres Effektes auf die LCV Lipide und hinsichtlich ihres Verhaltens in unterschiedlichen Infektionsmodellen charakterisiert. Insgesamt sollen die im Projekt erhaltenen Erkenntnisse helfen, den Austrittsprozess von Lpn aus Wirtszellen besser zu verstehen.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
Teilprojekt zu
SPP 2225:
Wirtszellaustritt intrazellulärer Pathogene