Konfokales Laserscanning Mikroskop für Lebendbildgebung

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2020
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 446967193

Live imaging stellt eine zentrale Methode für die Forschungsarbeiten im Laboratorium von Prof. Großhans dar. Aufbauend auf klassischer Immunhistologie von fixierten Proben werden Entwicklungsprozesse in ihrer Dynamik auf Längenskalen zwischen subzellulären Strukturen bis zur Gewebeebene untersucht. Die Zeitskala bewegt sich zwischen 100 ms bis zu Stunden. Dynamische Daten dokumentieren die Geschichte und Zukunft eines ausgewählten Zeitpunkts und sind damit viel informationsreicher als Bilder von fixierten Embryonen. Dynamische Bilddaten erlauben die Analyse von zeitlichen Änderungen der gemessenen Parameter, wie z. B. Zellquerschnittsfläche, Junctionlänge, Myosinaktivität. Mit dynamischen und multimodalen Daten kann untersucht werden, ob eine Korrelation von z. B. hoher Myosinmenge mit dem Verlauf der Querschnittsfläche mehrere Sekunden später besteht (cross correlation). Die Fluoreszenzmarkierung geschieht in den meisten Fällen durch genetisch kodierte Farbstoffe (GFP und Varianten), die als Fusionsproteine oder Reporterproteine exprimiert werden. In vielen Fällen – und in Zukunft immer mehr – erfolgt die genetische Markierung am endogenen Locus, so dass unter Umständen mit niedrigem Signal zu rechnen ist.Beim live imaging sind drei Qualitäten zentral: Signalqualität (Signal-Rausch-Verhältnis), Aufnahmegeschwindigkeit, Bildauflösung. State-of-the-art Mikroskope für live imaging verwenden Strategien zur Steigerung der Signaldetektion oder Verminderung der Phototoxizität. Eine aktuelle Strategie zur Erhöhung der Sensitivität, Auflösung sowie Geschwindigkeit ist der Einsatz eines Flächendetektors, der anstelle der Lochblende im Lichtweg platziert wird. Durch diese Methode werden zwei Probleme gelöst: Detektion (fast) aller Photonen und erhöhte räumliche Auflösung über das Abbe Kriterium hinaus. Des Weiteren können bei geeigneter Beleuchtung mit dem Flächendetektor mehrere Linien (bis zu 8 im Falle einer Schlitzanregung) gleichzeitig detektiert werden, was zu einer vielfach erhöhten Scangeschwindigkeit führt. Für eine akzeptable Signalqualität bei live imaging werden Hybriddetektoren benötigt, die sich durch eine große Signaldynamik sowie einer Quantenausbeute von bis zu 50% auszeichnen.Eine signifikante Erweiterung der Funktionalität von Konfokalsystemen stellt der Einsatz von UV Lasern im Bereich zwischen 355 nm (begrenzt durch die optische Durchlässigkeit von Glas) und 400 nm dar. Gepulste UV Laser erzeugen eine Energiedichte, die alle Strukturen im Fokusvolumen unspezifisch zerstören. Continuous wave UV Laser werden für das spezifische Öffnen von chemischen Bindungen (uncaging) verwendet.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Konfokales Laserscanning Mikroskop für Lebendbildgebung
• Gerätegruppe: 5090 Spezialmikroskope
• Antragstellende Institution: Philipps-Universität Marburg
• Leiter: Professor Dr. Jörg Großhans