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Verwendung von primären Fibroblasten und iPSC-derivierten Neuronen von Patienten mit AP-4-assoziierter Hereditärer Spastischer Paraplegie zur Durchführung eines Autophagie-basierten phänotypischen Small Molecule Screenings zur Identifikation neuer therapeutischer Ansätze

Antragsteller Dr. Afshin Saffari
Fachliche Zuordnung Klinische Neurologie; Neurochirurgie und Neuroradiologie
Kinder- und Jugendmedizin
Förderung Förderung von 2020 bis 2023
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 448402208
 
Erstellungsjahr 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Die Hereditären Spastischen Paraplegien (HSP) sind eine Gruppe von über 80 verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und die häufigste Ursache für genetisch bedingte spastische Lähmungen. Bi-allelische pathogene Varianten in Genen, die für Untereinheiten des Adapterproteinkomplexes 4 (AP-4) kodieren, führen zu prototypischen, jedoch wenig verstandenen Formen von komplexen HSP bei Kindern, den AP-4-assoziierten HSP. Diese Gruppe umfasst vier abgegrenzte Entitäten: SPG47 (AP4B1, OMIM #614066); SPG50 (AP4M1, OMIM #612936); SPG51 (AP4E1, OMIM #613744); und SPG52 (AP4S1, OMIM #614067). Vorangegangene Arbeiten haben das zentrale Autophagieprotein und die Lipid- Scramblase ATG9A als Haupt-Cargo von AP-4 identifiziert, was eine Verbindung zwischen dem Verlust der AP-4-Funktion und defekter Autophagie herstellt . Eine AP-4-Defizienz in nichtneuronalen und neuronalen Zellen führt zu einer Akkumulation von ATG9A im trans-Golgi-Netzwerk (TGN), was für verschiedene Zellmodelle, einschließlich Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) von AP-4-HSP-Patienten abgeleitet wurden, gezeigt wurde. Aus diesen Vorarbeiten und den überlappenden neuronalen Phänotypen von AP-4- und Atg9a-Knockout-Mäusen ergibt sich das folgende Arbeitsmodell für die AP-4-Defizienz : (1) AP-4 ist erforderlich für den Transport von ATG9A aus dem TGN; (2) Loss-of-function Varianten in AP-4-Untereinheiten führen zu einem Verlust der AP-4-Funktion; (3) ATG9A akkumuliert im TGN und führt zu einer Reduktion der axonalen ATG9A Pools; (4) das Fehlen von ATG9A am distalen Axon beeinträchtigt die Autophagie und führt zu axonaler Degeneration. Derzeit gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten für AP-4-HSP. In dieser Studie nutzen wir die fehlerhafte Lokalisierung von ATG9A im Zellinneren als quantifizierbaren Messwert für die AP-4-Defizienz, um ein groß angelegtes, automatisiertes, multiparametrisches, unvoreingenommenes small molecule Screening zur Modulation des ATG9A-Transports in patienteneigenen Zellen durchzuführen. Wir nutzten diese Plattform um eine Bibliothek von 28.864 neuartigen small molecules in AP-4-defizienten Patientenfibroblasten zu untersuchen und konnten 503 Verbindungen identifizieren, die ATG9A vom TGN ins Zytoplasma umverteilen. Durch eine Reihe von orthogonalen Assays in neuronalen Zellen, einschließlich differenzierter AP4B1KO-SH-SY5Y-Zellen und hiPSC Neuronen von AP4-HSP- Patienten, identifizierten wir 5 neuartigen Verbindungen, die den neuronalen Phänotypen des AP-4-Mangels korrigieren. In einer umfassenden multiparametrischen Analyse erwies sich das small molecule BCH-HSP-C01 als führende Verbindung. Strategien zur Aufklärung der molekularen Mechanismen, einschließlich transkriptomischer und proteomischer Analysen, zeigten, dass BCH-HSP-C01 den intrazellulären Vesikeltransport moduliert und die neuronale Autophagie erhöht, möglicherweise durch differentielle Expression mehrerer RAB (Rasassociated binding) Proteine. Diese Ergebnisse definieren molekulare Regulatoren des intrazellulären ATG9A-Transports und charakterisieren eine führende Verbindung zur Behandlung der AP-4-Defizient, was wichtige konzeptuelle Daten für zukünftige Studien liefert.

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