Visualisierung von Zell-Material-Wechselwirkungen mittels Coiled-Coil-basierter molekularer Kraftsensoren

• Antragstellerin: Professorin Dr. Kerstin Blank
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie ; Statistische Physik, Nichtlineare Dynamik, Komplexe Systeme, Weiche und fluide Materie, Biologische Physik
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 449551016

Säugerzellen besitzen eine Reihe von Sensoren und Aktuatoren, die mechanische Signale detektieren und verarbeiten. An der Grenzfläche zwischen Zellen und ihrer extrazellulären Matrix (EZM) findet Mechanosensing in Form von Rezeptor-übermittelter Kraftübertragung an fokalen Adhäsionen statt. Es ist weitgehend bekannt, dass viele Proteine in fokalen Adhäsionen (z. B. Integrine) mit einer Änderung ihrer Konformation auf eine anliegende Kraft reagieren. Diese Konformationsänderung liefert Input für nachgeschaltete Signalwege. Es ist jedoch weitgehend unklar, welcher Betrag der Kraft notwendig ist, um die jeweilige Konformationsänderung zu induzieren. Im Rahmen des beantragten Projektes soll eine neue Generation Peptid-basierter molekularer Kraftsensoren (MKS) entwickelt werden. Diese MKS wandeln die anliegende Kraft in ein Fluoreszenzsignal um und erlauben so die Detektion der an den Rezeptoren wirkenden Kräfte.Das beantragte Projekt ist inspiriert von natürlichen, mechanoresponsiven EZM Proteinen und fokussiert sich auf die Entwicklung von Peptid-basierten MKS, deren Grundgerüst aus sogenannten Coiled-Coils (CCs) besteht. Die CCs werden zunächst auf Einzelmolekülebene mechanisch vermessen und anschließend mit dem fluoreszenten Read-Out ausgestattet. Im Einzelnen sind folgende Schritte geplant:1. Basierend auf einem thermodynamisch hochstabilen CC, wird eine Bibliothek an CCs entwickelt. Diese CCs besitzen jeweils verschiedene mechanische Stabilitäten, wobei die thermodynamische Stabilität unverändert hoch bleibt. Die mechanische Charakterisierung erfolgt mittels dynamischer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, um die mechanischen Stabilitäten in Abhängigkeit von der Kraftladungsrate zu ermitteln.2. Die mechanisch kalibrierten CCs werden in MKS konvertiert, welche ihren mechanischen Zustand mittels eines Fluoreszenzsignals anzeigen. Dazu wird Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) verwendet. Das entsprechende Donor-Akzeptor-Paar wird so platziert, dass die intakten MKS eine hohe FRET Effizienz besitzen. FRET ist hingegen unterbrochen, wenn die MKS-Komponenten mechanisch getrennt werden.3. Die neuen MKS werden in Zellkultur-Experimenten verwendet, um molekularen Kräfte zwischen Integrinen und ihren extrazellulären Liganden zu messen. Darüber hinaus soll auch das Zwischenspiel verschiedener Integrin-Subklassen in zeitabhängigen Zellädhesionsexperimenten untersucht werden. Hier werden neue Erkenntnisse in Bezug auf mechanische Signalwege erwartet, an denen Integrine beteiligt sind.Zusammenfassend erlaubt das neue EZM-inspirierte MKS Design die sensitive Detektion molekularer Kräfte. Das langfristige Ziel ist die Visualisierung von Zell-generierten Kräften in Echtzeit und mit der bestmöglichen räumlichen Auflösung. Darüber hinaus ist es geplant, diese leistungsfähige MKS Plattform zur Synthese von mechanisch-programmierten, EZM-mimetischen Hydrogelen zu verwenden, um intelligente 3D Zellkultursysteme für biomedizinische Anwendungen zu entwickeln.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Österreich