Untersuchung von Lokalisierung und Schicksal von m6A-modifizierter mRNA in lebenden Zellen als Einzelmolekül
Biophysik
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Genexpression und Zellwachstum unterliegen einer strengen und ausgeklügelten Kontrolle durch genetische und epigenetische Rückkopplungsschleifen. In den letzten zehn Jahren hat die RNA-Modifikation als zusätzliche Ebene der genetischen Regulierung an Aufmerksamkeit gewonnen. Seit der Entdeckung der ersten posttranskriptionellen RNA-Modifikation in den 1950er Jahren, Pseudouridin, wurden über 200 posttranskriptionelle RNA-Modifikationen in der RNA entdeckt. In jüngster Zeit hat sich der Schwerpunkt von der Identifizierung chemischer RNA- Modifikationen auf das Verständnis ihrer biologischen Funktionen verlagert, wodurch ein neuer Bereich der Molekularbiologie namens "Epitranskriptomik" entstanden ist. Eine solche dynamische RNA-Modifikation ist N6-Methyladenosin (m6A). Auf globaler Ebene beeinflusst m6A mehrere wesentliche zelluläre Prozesse: die Differenzierung in verschiedenen Zelltypen; trägt zu zahlreichen Krebsarten bei; steuert die zirkadiane Uhr. Die meisten m6A-Modifikationen werden von einem Multiprotein-Schreiber-Komplex (METTL3/METLL14) installiert. METTL3 ist bekanntermaßen stark im Zellkern konzentriert. Die biologische Funktion von m6A wird durch m6A-RNA-bindende Proteindomänen erreicht und gefördert. m6A-Modifikationen sind in der Nähe von Stopcodon und in den 3'-untranslatierten Regionen (3'UTR) von mRNAs stark angereichert. Die 3'-UTR beeinflusst die mRNA-Stabilität, ihre zelluläre Lokalisierung und die Translationseffizienz. Ein Beispiel für die Bedeutung von m6A in einer 3'-UTR ist die geschlechtsbestimmende Region y-box 2 (SOX2) mRNA, die ein Hochrisiko-Onkogen ist. Die SOX2- mRNA wurde als Ziel von METTL3 identifiziert, das die mRNA-Transkriptstabilität von SOX2 modifiziert. Diese Stabilisierung verleiht Glioblastom-Stammzell-ähnliche Eigenschaften wie z. B. eine erhöhte Radioresistenz. Insgesamt bieten die verfügbaren biochemischen, strukturellen und zellulären Daten umfassende Einblicke in die Auswirkungen von m6A-Modifikationen auf die RNA und ihre dynamische Natur. Trotz der mehr als 1.300 veröffentlichten Studien über m 6A - modifizierte RNAs bleiben jedoch eine Reihe grundlegender Fragen bezüglich des molekularen und mechanistischen Verhaltens von 3'-UTR-m6A-modifizierten mRNAs unbeantwortet. Ziel des Projekts ist es, diese Fragen zu klären, indem die Effizienz, die Kinetik und die Ribosomenbelastung der Translation anhand einer 3'-UTR der SOX2-mRNA als m6A-Modellsystem untersucht werden. Um dies zu erreichen, wurde eine Kombination aus modernsten Einzelmolekül-RNA-Tracking-Methoden, mRNA-Translationsvisualisierungstechniken und ultrahochauflösender zellbasierter Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass m6A beinhaltende mRNA (methylierte mRNA) einer geringeren Proteinexpression hat. Dies konnte mechanistisch auf eine geringere Ribosomenanzahl zurückgeführt werden. Weiterhin konnte erstmals in einem zellulären Kontext mit Einzelmolekülauflösung gezeigt werden, dass METTL3 selbst an der mRNA-Regulation durch Interaktion mit mRNA beteiligt ist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass METTL3 beide mRNA-Arten (methylierte und unmethylierte mRNA) mit hoher Affinität bindet und an der ribosomalen Beladung beteiligt ist. METTL3-Knockdown-Experimente zeigten, dass seine zelluläre Reduktion einen negativen Effekt auf die globale Translationsleistung von beiden (methyliert und unmethylierter) mRNAs hat. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass METTL3 als Regulator der Ribosomenanzahl wirkt und selektiv für einzelne mRNA- Translationsstellen ist. Außerdem lassen die Daten darauf schließen, dass methylierte mRNA einen schnelleren mRNA-Degradation erfährt. Insgesamt deuten die Daten darauf hin, dass METTL3 nicht auf seine Kernfunktion (Methylierung von RNA) beschränkt ist, sondern auch an der Modulation der zytosolischen mRNA-Stabilität und Proteinkonzentration beteiligt ist. Fox SOX2 Biologie, METTL3 stellt einen entscheidenden Faktor der Glioblastom therapeutisches Ziel.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Probing Transient Riboswitch Structures via Single Molecule Accessibility Analysis. Methods in Molecular Biology, 37-51. Springer US.
Welty, Robb; Schmidt, Andreas & Walter, Nils G.
-
Spontaneous Confinement of mRNA Molecules at Biomolecular Condensate Boundaries. Cells, 12(18), 2250.
Perelman, Rebecca T.; Schmidt, Andreas; Khan, Umar & Walter, Nils G.
-
Utilizing functional cell‐free extracts to dissect ribonucleoprotein complex biology at single‐molecule resolution. WIREs RNA, 14(5).
Duran, Elizabeth; Schmidt, Andreas; Welty, Robb; Jalihal, Ameya P.; Pitchiaya, Sethuramasundaram & Walter, Nils G.
