Sequenz-spezifische Aktivität von Shiga-Toxin und anderen Ribosom-inaktivierenden Proteinen gegenüber verschiedenen Nukleinsäuresubstraten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ribosom-inaktivierenden Proteine (RIPs) depurinieren Nukeinsäuren und hinterlassen Stellen ohne Base im Zuckerphosphatrückrad, sogenannte abasische Stellen. Die Sequenzabhängigkeit dieser Depurinierung war noch nicht genau untersucht. Ziel des Projektes war es daher eine Methode zu entwickeln, welche die Sequenzabhängigkeit mittels Hochdurchsatzsequenzierung ermitteln kann. Die hier etablierte Methode ermittelt die Sequenzabhängigkeit der RIP-Aktivität anhand eines randomisierten Pools an DNA-Sequenzen, welche mittels solid-phase synthesis generiert, oder RNA-Sequenzen, welche aus den DNA-Sequenzen mittels in-vitro Transkription hergestellt wurden. Randomisiert wurde einmal der Sarcin-Rizin-Loop (SRL), das vermutliche Ziel der RIPs in Zellen, oder der Loop einer DNA/RNA hairpin. Nach Inkubation mit einem RIP kann das Zuckerphosphatrückrad an den abasischen Stellen mithilfe von Anilin gespalten werden. Gespaltene und ungespaltene Moleküle wurden mittels denaturierender Polyacrylamid Elektrophorese (PAGE) getrennt und die ungespaltenen Moleküle aus dem Gel zurückgewonnen, um diese zu sequenzieren. Die ungespaltenen DNA oder RNA Moleküle wurden vor und nach der Behandlung mit RIPs mittels Illumina-Technologie sequenziert und die Häufigkeit ihres Auftretens verglichen, um deren Eignung als RIP-Substrat zu quantifizieren. Die Methode wurde mit Saporin, einem Modell-RIP, etabliert. Die Ergebnisse zeigen, dass Saporin Adenine in verschiedensten, einzelsträngigen Sequenzen depurinieren kann, es jedoch DNA Tetraloops mit der Sequenz ACGN als Substrat bevorzugt. Die Sequenzierergebnisse wurden anhand ausgewählter Sequenzen aus jedem Pool mittels PAGE bestätigt. Weiterhin wurde die Reaktionskinetik des empfindlichsten Tetraloops (ACGA) mit derer des GAGA-Tetraloops, welcher wie z. B. im SRL bisher das angenommene Substrat von RIPs war, verglichen. Die Kinetik zeigte eindeutig, dass die ACGN-Tetraloops deutlich bessere Substrate von Saporin sind. Zusammenfassend wurde eine Methode zur Bestimmung der Sequenzspäzifität von RIPs mittels Hochdurchsatzsequenzierung entwickelt. Mithilfe dieser Methode wurden, in Abwesenheit anderer Faktoren, DNA Tetraloops mit der Sequenz ACGN als beste Substrate von Saporin identifiziert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Analysis of the Sequence Preference of Saporin by Deep Sequencing. ACS Chemical Biology, 17(9), 2619-2630.
Hauf, Samuel; Rotrattanadumrong, Rachapun & Yokobayashi, Yohei
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High-throughput analysis of a sequence-specific depurination enzyme. Presented at: The 49th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry, November 2022, Tokyo, Japan
Samuel Hauf; Rachapun Rotrattanadumrong & Yohei Yokobayashi
