Biochemische und strukturelle Charkterisierung des SARS-CoV-2 non-structural protein 16 (Nsp16), eine cap ribose 2’O-methyltransferase

• Antragsteller: Professor Dr. Markus Landthaler; Dr. Grzegorz Popowicz; Professor Dr. Michael Sattler
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 458682959

• Erstellungsjahr: 2023

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Nsp10 und nsp16 sind zwei nicht-strukturelle Proteine, die von SARS-CoV-2 kodiert werden, dem Virus, das COVID-19 verursacht. Sie bilden einen heterodimeren Komplex, der als 2'-O-Methyltransferase (MTase) fungiert und die Methylierung der 2'-OH-Gruppe des ersten Nukleotids (normalerweise ein Adenin) der viralen RNA-Kappe katalysiert. Durch die Methylierung wird die Cap-Struktur von Cap-0 (me7GpppA) in Cap-1 (me7GpppAm) umgewandelt, was zelluläre mRNAs nachahmt und dem Virus hilft, der Immunerkennung durch Wirtsfaktoren wie MDA5 und IFIT1 zu entgehen. Kristallstrukturen von nsp10/nsp16-Komplexen in Anwesenheit oder Abwesenheit von SAM (dem Methyl-Donor) wurden bereits gelöst und lieferten molekulare Details der Enzym-Substrat-Interaktion und der Konformationsänderungen bei der Produktfreisetzung. Die Strukturen geben auch Aufschluss über die Auswirkungen klinischer Varianten und früherer SARS-CoV- Ausbruchsstämme auf die enzymatische Aktivität von nsp10/nsp16. Der nsp10, nsp16-Komplex ist ein potenzielles Ziel für die Entwicklung antiviraler Wirkstoffe, da Inhibitoren, die seine Aktivität blockieren, die virale Replikation und die Immunevasion beeinträchtigen könnten. Die Ziele dieses Projekts waren die Charakterisierung der RNA-Substrate und der Methylierungsspezifizität mit Hilfe von biochemischen Assays, NMR und Strukturbiologie. MTase Glo Assays wurden etabliert und zeigten die RNA-Substratanforderungen und die Spezifität des nsp10/nsp16-Komplexes. Strukturbiologische, biophysikalische und biochemische Experimente zeigten eine dynamische Lid-Domäne in nsp14, die überraschenderweise auch die Bildung eines ternären nsp10-nsp14-nsp16-Komplexes ermöglicht. Unsere Ergebnisse bilden die Grundlage für künftige Experimente zur Identifizierung von Inhibitoren der nsp16-Methyltransferase-Aktivität.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• Characterization of SARS-CoV-2 replication complex elongation and proofreading activity. Scientific Reports, 12(1).
  Jones, Alisha N.; Mourão, André; Czarna, Anna; Matsuda, Alex; Fino, Roberto; Pyrc, Krzysztof; Sattler, Michael & Popowicz, Grzegorz M.
  
• Refolding of lid subdomain of SARS-CoV-2 nsp14 upon nsp10 interaction releases exonuclease activity. Structure, 30(8), 1050-1054.e2.
  Czarna, Anna; Plewka, Jacek; Kresik, Leanid; Matsuda, Alex; Karim, Abdulkarim; Robinson, Colin; O.’Byrne, Sean; Cunningham, Fraser; Georgiou, Irene; Wilk, Piotr; Pachota, Magdalena; Popowicz, Grzegorz; Wyatt, Paul Graham; Dubin, Grzegorz & Pyrć, Krzysztof
  
• Despite the odds: formation of the SARS-CoV-2 methylation complex. Nucleic Acids Research, 52(11), 6441-6458.
  Matsuda, Alex; Plewka, Jacek; Rawski, Michał; Mourão, André; Zajko, Weronika; Siebenmorgen, Till; Kresik, Leanid; Lis, Kinga; Jones, Alisha N.; Pachota, Magdalena; Karim, Abdulkarim; Hartman, Kinga; Nirwal, Shivlee; Sonani, Ravi; Chykunova, Yuliya; Minia, Igor; Mak, Paweł; Landthaler, Markus; Nowotny, Marcin ... & Czarna, Anna