Evolution von genregulatorischen Netzwerken in Primaten abgeleitet von Perturbationsexperimenten

• Antragstellerinnen / Antragsteller: Professor Dr. Wolfgang Enard; Privatdozentin Dr. Ines Hellmann
• Fachliche Zuordnung: Evolutionäre Zell- und Entwicklungsbiologie der Tiere
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 458888224

Das Verständnis der Evolution von regulatorischen Netzwerken ist entscheidend für das Verständnis biologischer Vielfalt und der menschlichen Biologie. In diesem Zusammenhang sind Vergleiche zwischen Primaten nicht nur von besonderer Relevanz, weil sie unser Wissen über die menschliche Evolution bereichern, sondern auch weil sie die Kluft zwischen Mensch und Maus, unserem wichtigsten Modellorganismus, überbrücken. Während viele artübergreifende Vergleiche von Genexpressionslevels durchgeführt wurden, ermöglichen vergleichbare und genetisch manipulierbare Zellsysteme in Primaten neue Erkenntnisse über die molekulare Evolution der Genregulation. Die Verbindung von CRISPR-basierten Perturbationen und Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung (scRNA-seq) ist eine bahnbrechende Technologie, um Genregulation zu untersuchen. Eine prominente Variante eines solchen Einzelzell-CRISPR-Screens setzt sogenannte single guide RNAs (sgRNA) ein, um ein Fusionsprotein, bestehend aus einer katalytisch-inaktiven Cas9 (dCas9) und einer Repressordomäne (KRAB), an bestimmte Promotoren zu binden. CRISPRi reduziert die Expression des Zielgenes und scRNA-seq ermöglicht es, die transkriptomweiten Effekte dieser Reduzierungen zu quantifizieren. Solche Studien werden massgeblich zu unserem Verständnis genregulatorischer Netzwerke (GRN) beitragen. Der evolutionäre Aspekt solcher Netzwerke abgeleitet von Perturbationsexperimenten ist bisher jedoch nicht erforscht.In dem hier vorgeschlagenen Projekt wollen wir einen Beitrag zur Erforschung der Evolution von GRNs liefern, indem wir Perturbationen von GRNs in neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) von Primaten analysieren. Dieses Ziel werden wir durch den Einsatz unserer etablierten induzierten pluripotenten Stammzelllinien (iPSCs) von Mensch, Gorilla, Orang-Utan und Langschwanzmakak erreichen, wobei wir iPSCs von zwei Individuen pro Spezies mit einem induzierbaren dCas9-KRAB-Gen in einem definierten genomischen Lokus generieren werden. Diese iPSCs werden zu NPCs differenziert und mit sgRNAs gerichtet auf 100 Transkriptionsfaktoren (TF), die in NPCs exprimiert sind, transduziert. Neun Tage nach Beginn der dCas9-KRAB-Induktion werden die Zellen für scRNA-seq gesammelt. Die Sequenzierung von 500 Zellen pro Spezies und TF sollte uns genügend Daten liefern, um Netzwerkkonservierung statistisch valide zu untersuchen. Die Korrelation dieser Konservierung mit relevanten Eigenschaften der TFs und ihrer Targets wird uns einzigartige Erkenntnisse über die Evolution von GRNs in Primaten liefern. Im Anschluss werden wir 18 evolutionär interessante TFs auswählen, um diese mit Einzelzell Multiome Analysen, zu untersuchen. Dies wird mögliche Wechselwirkungen zwischen Transeffekten und den cis-regulatorische Landschaften der Zielgene offenlegen. Diese funktionellen Daten werden neue Schlussfolgerungen über die Evolution der Genregulierung erlauben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen