Mechanismus von kleinen Hitzeschockprotein als Proteinsequestrasen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Kleine Hitzeschockproteine (sHsps) sind wichtige Komponenten des Proteinqualitätskontrollsystems (PQC). Sie binden fehlgefaltete Proteine und bilden mit diesen sHsp/Substrat-Komplexe. Diese Komplexe können sehr groß sein, einschließlich mikroskopisch sichtbarer Ablagerungen, die eine sHsp-Sequestrase-Aktivität definieren. S. cerevisiae Sequestrase-Mutanten weisen spezifische Phänotypen auf, welche verwendet wurden um zu zeigen, dass die Sequestrase-Aktivität von sHsps evolutionär konserviert ist und in E. coli, C. elegans und menschlichen sHsps zu finden ist. Sequestrase-positive C. elegans sHsps weisen längere, ungeordnete N-terminale Segmente mit aromatischen Resten auf, die für Substratinteraktion zentral sind. Um die sHsp-Sequestrase-Aktivität genauer zu analysieren, versuchten wir hochauflösende Strukturen der Hefe Hsp42 Sequestrase durch CryoEM und von sHsp/Substrat-Komplexen durch CryoET zu erhalten. Dies war aufgrund der Domänenflexibilität und Oligomerdynamik (Hsp42) bzw. der Heterogenität der sHsp/Substrat-Komplexe nicht möglich. Daher wurde eine detaillierte Struktur-Funktions-Analyse von Hsp42 durchgeführt. Wir entwickelten ein Alpha- Fold3-Modell von Hsp42-Oktameren auf der Grundlage der Größenbestimmung durch verschiedene biochemische Methoden. Hsp42 Oktamere bilden eine scheibenförmige Struktur, die von der konservierten a-Kristallin-Domäne gebildet wird. Durch DSSO-Quervernetzungs- Experimente und Identifizierung der quervernetzten Peptide durch Massenspektrometrie wurde diese Architektur weitgehend bestätigt. Die N-terminalen und ungeordneten PrLD- und IDD-Domänen sind oberflächenexponiert, wie eine limitierte Proteolyse von Hsp42 zeigt. Wir bestätigen, dass die PrLD-Domäne für die Hsp42 Sequestrase-Aktivität essentiell ist, und zeigen, dass die IDD-Domäne die Größe der Hsp42/Substrat-Komplexes kontrolliert. Darüber hinaus spielt die IDD eine wichtige Rolle bei der Kooperation mit Hsp70/Hsp100-Disaggregasen. Die Rückgewinnung von Hsp42-gebundenen Substraten durch Hsp70/Hsp100 ist bei Deletion der IDD stark vermindert. Diese Erkenntnis deutet darauf hin, dass beide Phasen der sHsp-Funktion, die Sequestrierung fehlgefalteter Proteine und die Freisetzung gebundener Substrate durch Proteindisaggregasen, in Hsp42 reguliert sind. Außerdem untersuchten wir die Zusammenarbeit von sHsps mit Proteindisaggregasen am Beispiel von Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa besitzt zwei sHsps, IbpA und Hsp20, und zwei Disaggregationssysteme, Hsp70/ClpB und ClpG. Die Gene, die für Hsp20 und ClpG kodieren, sind ko-organisiert und spielen eine Rolle beim Schutz der Bakterien vor extremem Hitzestress. Wir untersuchten, ob die Erweiterung der sHsp- und der Disaggregase-Repertoires funktionell gekoppelt sind. Während beide sHsps die Hsp70/ClpB-Disaggregationsaktivität verstärken zeigen sich Unterschiede in der Kooperation mit ClpG. Während IbpA die ClpG Aktivität stark hemmet, kann Hsp20 diese konzentrationsabhängig erhöhen. Diese spezifische Zusammenarbeit weist auf eine Erweiterung die sHsp-Funktion in PQC-Systemen hin.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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The cytoprotective sequestration activity of small heat shock proteins is evolutionarily conserved. Journal of Cell Biology, 221(10).
Shrivastava, Aseem; Sandhof, Carl Alexander; Reinle, Kevin; Jawed, Areeb; Ruger-Herreros, Carmen; Schwarz, Dominic; Creamer, Declan; Nussbaum-Krammer, Carmen; Mogk, Axel & Bukau, Bernd
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The Diverse Functions of Small Heat Shock Proteins in the Proteostasis Network. Journal of Molecular Biology, 434(1), 167157.
Reinle, Kevin; Mogk, Axel & Bukau, Bernd
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Balanced activities of Hsp70 and the ubiquitin proteasome system underlie cellular protein homeostasis. Frontiers in Molecular Biosciences, 9.
Jawed, Areeb; Ho, Chi-Ting; Grousl, Tomas; Shrivastava, Aseem; Ruppert, Thomas; Bukau, Bernd & Mogk, Axel
