Charakterisierung des p63/p73 Hetero-Tetramers mit Hilfe selektiver DARPins

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Dötsch
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 464606319

p63 ist ein Mitglied der p53 Protein Familie und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung mehrzellschichtiger Epithelgewebe wie z.B. der Haut. Die Isoform, die in der Haut exprimiert ist – ΔNp63α – hat keine N-terminale Transaktivierungsdomäne und fungiert vor allem als „Pionierfaktor“, der das Chromatin in Keratinozyten organisiert. Mutationen in p63 führen sowohl im Mensch als auch in der Maus zu schweren Entwicklungsschäden. Zusätzlich zu p63 exprimieren Zellen in der Basalschicht von mehrzellschichtigen sowie pseudo-mehrzellschichtigen Epithelgeweben (Trachea) verschiedene Isoformen eines weiteren Familienmitgliedes, p73. Beide Proteine bilden Tetramere mittels einer speziellen Oligomerisierungsdomäne. Wenn beide Proteine in vitro vorliegen, bilden sie bevorzugt ein Hetero-Tetramer mit einer 2:2 Stöchiometrie. Unsere frühere Strukturbestimmung hat die molekularen Interaktionen identifiziert, die für die Bildung des Hetero-Tetramers verantwortlich sind. Strukturbasiertes Design hat uns ermöglicht, Mutanten zu kreieren, die entweder das Hetero-Tetramer stabilisieren oder seine Bildung unterdrücken. Diese Mutanten stellen nun ein hervorragendes Werkzeug dar, um die biologische Funktion des Hetero-Tetramers zu untersuchen. Das Fehlen der Transaktivierungsdomäne in ΔNp63α reduziert seine transkriptionelle Aktivität und macht die Organisation des Chromatins zur Hauptfunktion dieser Isoform. Die Kombination mit transkriptionell aktiven p73 Isoformen kann daher für spezielle transkriptionelle Programme verantwortlich sein. Wir zeigen hier Belege, dass das Hetero-Tetramer in vivo existiert, z.B. in der Maushaut. Wir beschreiben Experimente, seine biologische Funktion zu charakterisieren, in dem wir untersuchen, welche p73 Isoformen in relevanten Geweben exprimiert werden, in welchen Zellen in menschlichem und murinem Gewebe es gebildet wird, wo es an die DNA bindet (ChIPseq), welche Gene es reguliert (RNAseq) und mit welchen Faktoren es kooperiert („proximity labeling“), um Transkription und Chromatinänderungen zu steuern. Als Werkzeug für diese Untersuchungen haben wir ein Designed Ankyrin Repeat Protein – DARPin – kreiert, das mit hoher Selektivität und mit sub-nM Affinität an das Hetero-Tetramer bindet. Experimente werden in Zellkultur relevanter Zellen sowie in Mensch- und Mausgewebe durchgeführt werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen