Dimer-spezifische GPCR-Liganden: Synthese und biologische Untersuchungen
Final Report Abstract
G-Protein gekoppelte Rezeptoren spielen innerhalb des menschlichen Körpers in einer Vielzahl von physiologischen wie auch pathologischen Prozessen eine Rolle und stellen daher wichtige Zielstrukturen der Arzneimitteltherapie dar. Traditionell nahm man an, dass Klasse A GPCRs, zu denen beispielsweise Rezeptoren für Dopamin, Adrenalin und andere biogene Amine gehören, als Monomere vorliegen. In der Zwischenzeit geht man jedoch davon aus, dass diese Rezeptoren einem dynamischen Prozess der Oligomerisierung unterliegen und sowohl mit gleichartigen als auch verschiedenen Rezeptoren innerhalb der Zellmembran homo- bzw. heterodimerisieren. Ziel unserer Arbeiten war das Verständnis der GPCR-Dimerisierung mittels Dimer-spezifischer Liganden zu erweitern und Grundlagen für eine spätere Ausnutzung der Dimerisierung in der Arzneimitteltherapie zu schaffen. Für das Design Dimerspezifischer Liganden eignet sich im Besonderen das Konzept der bivalenten Liganden, welche aus zwei Rezeptorerkennungselementen (den Pharmakophoren) bestehen, die über einen geeigneten Linker miteinander verbunden werden. Das Vorhandensein von zwei Pharmakophoren sollte durch die Bindungsenergie beider orthosterer Gruppen zu einem Gewinn an Bindungsaffinität führen, solange der Linker eine geeignete Struktur und Länge aufweist und nicht an anderer Stelle zu repulsiven Wechselwirkungen führt. Das Konzept der bivalenten Liganden haben wir bereits in der ersten Projektförderphase erfolgreich zur Synthese homobivalenter Liganden angewendet, welche in der Lage sind Dopaminrezeptoren vom D2R bzw. D3R-Typ zu erkennen. Innerhalb dieser Förderperiode haben wir durch Austausch der Pharmakophore aber auch durch Variation des Linkerdesigns und der Länge den Pool an bivalenten Liganden erheblich erweitert, sowie die generelle Anwendbarkeit der Synthesestrategie demonstriert. Um die Wirkung bivalenter Liganden auf einzelne Rezeptoren untersuchen zu können haben wir in dieser Förderphase ein Verfahren der hochauflösenden TIRF-Mikroskopie für die D2SR- und D2LR-Subtypen sowie den verwandten D3R etabliert. Mit Hilfe der bivalenten Liganden sowie der von entwickelten hochaffinen Fluoreszenzliganden konnten wir auf Einzelmolekülebene die dynamische Homodimerisierung dieser Rezeptoren analysieren. Dabei zeigte sich, dass die einzelnen Rezeptorisoformen unterschiedlich starke Dimerisierungstendenzen aufweisen, welche durch Liganden beeinflusst werden können: sowohl die Inkubation mit monovalenten Agonisten als auch mit bivalenten Liganden erhöht die Dimerisierungstendenz, während die Inkubation mit monovalenten Antagonisten keinen Einfluss ausübt. Neben der D2R-Homodimerisierung spielt auch die Heterodimerisierung mit anderen Rezeptoren, wie z.B. dem NTS1R eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Entstehung und Behandlung von Erkrankungen des ZNS. Ausgehend von der D3R- sowie den NTS1R-Kristallstrukturen entwickelten wir heterobivalente Liganden mit hydrophilen, von PEG-abgeleiteten Linker-Strukturen. Während alle Liganden auf der NTS1R Seite das vom endogenen Agonisten abgeleitete NT(8-13)-Pharmakophor enthielten, wurden auf der D2R-Seite drei unterschiedliche Ligandentypen, das antagonistische Eticloprid, das partialagonistische 2-Methoxyphenylpiperazin, sowie die agonistische N-Proplyaminoindan Partialstruktur, verwendet. In Radioligandbindungsstudien konnten wir für Liganden mit ausreichend langem Linker eindrucksvoll eine über 1000-fache Präferenz für den bivalenten Bindungsmodus im Vergleich zur monovalenten D2R-Affinität beobachten. In Untersuchungen zur Rezeptoraktivierung konnten wir darüber hinaus zeigen, dass im D2R/NTS1R-Dimer die Signalübertragung durch den NTS1R dominiert wird. Zukünftig könnten diese Dimer-spezifischen Liganden als molekulare Werkzeuge genutzt werden, gezielt Zellen bzw. Gewebe zu adressieren, die beide Rezeptorsubtypen exprimieren. Wie sich unsere bivalenten Liganden gegenüber anderen NTS1R/Dopaminrezeptor-Heterodimeren verhalten ist Gegenstand aktueller Untersuchungen im Rahmen eines Teilprojekts des Graduiertenkollegs GRK1910.
Publications
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