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Projekt
Protein Phosphatasen als essentielle Regulatoren der mechanischen Stressantwort
Antragstellerin
Professorin Dr. Maja Köhn
Fachliche Zuordnung
Zellbiologie
Förderung
Förderung seit 2021
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 388932620
Die Regulation der Proteinfunktion durch Phosphorylierung spielt eine Schlüsselrolle bei der zellulären Reaktion auf mechanischen Stress. Viele Proteine werden unter mechanischen Stressbedingungen dephosphoryliert, was darauf hindeutet, dass Phosphatasen entscheidend in diesem Prozess sind. Allerdings sind die Phosphatasen, die für die Dephosphorylierung wichtiger Proteine in der mechanischen Stressantwort verantwortlich sind, wie z.B. das Cochaperon BAG3 und der Aktin-Regulator FLNc, unbekannt. Wir haben verschiedene Ansätze angewendet, um Phosphatasen zu identifizieren, die funktionell wichtige phosphorylierte Aminosäuren in diesen Proteinen dephosphorylieren. Die Interaktome von BAG3 und FLNc wurden mittels Pulldown-Experimenten und Massenspektrometrie ermittelt. Zusätzlich haben wir die Fähigkeit der in den Interaktomen identifizierten Phosphatasen untersucht, bestimmte BAG3- und FLNc-Stellen in Phosphopeptiden in vitro zu dephosphorylieren. Darüber hinaus haben wir eine gezielte Phosphoproteomik-Methode aufgebaut, um die Dephosphorylierung von phosphorylierten Aminosäuren in BAG3 mit rekombinanten Phosphatasen nachzuweisen. Dies war sehr wichtig für Projekt, da es bisher nicht möglich war, selektive Antikörper für spezifische phosphorylierte Stellen in BAG3 herzustellen. So haben wir mögliche Phosphatasen für bestimmte BAG3- und FLNc-Stellen eingegrenzt. Ein Hauptziel der hier geplanten Arbeiten ist es, die identifizierten Interaktionen in vitro und in Zellen zu bestätigen. Für die in vitro-Arbeiten werden wir Dephosphorylierungs-Assays mit Phosphopeptiden und gezielte Phosphoproteomik sowie Western-Blot-Analysen anwenden. Um die zelluläre Dephosphorylierung und die funktionellen Konsequenzen unter mechanischem Stress zu untersuchen, werden wir chemische Inhibition oder Aktivierung einer Phosphatase anwenden. Ein weiteres Ziel ist es, die Phosphatase(n) zu untersuchen, die für die neu identifizierte, von mechanischem Stress abhängige Dephosphorylierung von drei nahe beieinander liegenden Phosphorylierungsstellen im Zytoskelettadaptor SYNPO2 verantwortlich sind, für die erste Daten auf eine Rolle bei der Filaminbindung hinweisen. Die phosphoproteomischen und funktionellen Studien werden in enger Zusammenarbeit mit Experten der Forschungseinheit durchgeführt, und die Interaktionen innerhalb der Einheit werden es ermöglichen, unsere Ergebnisse auf andere Zelltypen und Gewebe zu übertragen.
DFG-Verfahren
Forschungsgruppen
