Die Reparatur-Entscheidung bei DNA Brüchen: Mechanismus, Kontrolle, Bypass

• Antragsteller: Professor Dr. Boris Pfander
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 466479039

DNA Doppelstrang-Brüche (DSB) bedrohen als DNA Schäden nicht nur die Integrität des Genoms, sie sind auch wesentliche, molekulare Intermediate für Genom-Editierungsverfahren mit hoher Relevanz für die Biotechnologie. Für die DSB-Reparatur können eukaryotische Zellen einen von mehreren Reparaturmechanismen wählen, unter anderem die Homologe Rekombination. Die Produkte der unterschiedlichen DSB-Reparaturmechanismen sind jedoch genetisch unterschiedlich. Trotz der Abhängigkeit von Genom-Editierungsverfahren von dieser zellulären DSB-Reparaturentscheidung ist unser Verständnis über den dieser Entscheidung zu Grunde liegenden Mechanismus unvollständig. Wir wissen allerdings, dass diese Entscheidung während der Resektion der DSB-Enden, also während des ersten Schritts der homologen Rekombination, getroffen wird. Resektion selbst wird durch den Zellzyklus kontrolliert, sowie durch die lokale Chromatin-Umgebung. Viele der relevanten Kontrollmechanismen sind aber unbekannt oder mechanistisch nicht ausreichend verstanden. Entsprechend erfolglos waren bisherige Versuche, die DSB Reparatur Entscheidung von außen zu beeinflussen und homologe Rekombination zum präferierten DSB Reparatur Mechanismus zu machen.Dieser Antrag behandelt die biochemische Rekonstitution der Resektion mit aufgereinigten Proteinen und einem definierten Chromatin-Substrat. Wir werden dieses in vitro-System benutzen, um zu testen, durch welchen Mechanismus bekannte Regulatoren wie die Zellzyklus-Kinase CDK, der Nukleosomen-Remodeller Fun30/SMARCAD1 oder der Nukleosomen-Binder Rad9/53BP1 die Resektion beeinflussen. Hierfür haben wir bereits charakterisierte Proteine aus Saccharomyces cerevisiae zur Verfügung, welche wir für ein initiales System benutzen werden. Gleichzeitig werden wir auch erste Experimente zum humanen System durchführen. Dabei werden wir uns auf das Zusammenspiel zweier Faktoren konzentrieren, welche beide die Resektion begünstigen: zum einen den Tumorsuppressor BRCA1, welcher Nukleosomen mit Ubiquitin modifiziert, zum anderen den Nukleosomen-Remodeller Fun30/SMARCAD1.Ein genaues Verständnis der Resektionskontrolle ist erforderlich, um die DSB-Reparaturentscheidung von außen zu kontrollieren und Genomeeditierungs-Strategien voranzubringen. Der zweite Teil dieses Antrags behandelt deshalb unsere Strategie einen synthetischen Bypass der Resektions-Kontrolle zu erzeugen. Hierbei werden wir einen neuen Kontrollmechanismus untersuchen, welcher von der Zellzyklus-Kinase DDK anhängt. Im nächsten Schritt, werden wir versuchen, Resektion von der Zellzyklus-Kontrolle zu entkoppeln, einerseits von der neuen DDK-Kontrolle, andererseits von der bereits etablierten CDK-Kontrolle. Falls erfolgreich sollte ein solcher Bypass der Zellzykluskontrolle einer synthetischen Aktivierung von homologer Rekombination unabhängig von der Zellzyklusphase gleichkommen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen