Regulation der Chromatin-Remodellierung durch Notch1 in fibrotischen Erkrankungen

• Antragstellerin: Dr. Clara Dees
• Fachliche Zuordnung: Rheumatologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 467040214

In der vorgeschlagenen Studie, wollen wir die Interaktion des Notch1 Signalweges mit der epigenetischen Regulation der Transkription durch Histonmethylierung in der Fibrose untersuchen und mögliche therapeutische Optionen einer Inhibition von Histon-Demethylasen in fibrotischen Erkrankungen evaluieren.In früheren Studien konnten wir nachweisen, dass der Notch1 Signalweg ein wichtiger molekularer Mechanismus in der Fibroblasten-Aktivierung und der Fibrose bei systemischer Sklerose (SSc) ist. Basierend auf diesen Studien analysierten wir eine Fibroblasten-spezifische Aktivierung von Notch1 in Mäusen (Notch1act), welche progressive fibrotische Veränderungen der Haut zeigten. Eine Inhibition der Histon-Demethylase LSD1 verbesserte die durch die Notch1-Aktivierung hervorgerufenen fibrotischen Veränderungen sowohl in vitro als auch in vivo. Sequenzierung der aus der murinen Haut isolierten RNA, sowohl mit als auch ohne LSD1 Inhibition, identifizierte eine Fülle an differentiell exprimierten Genen (DEGs). Funktionelle Analysen dieser DEGs zeigten eine Häufung von Fibrose-relevanten Signalwegen, aber auch von Lipid- und PPAR als auch Mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalkaskaden. Ebenso zeigte sich eine Anreicherung von Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren SMAD3 und SMAD4.Um die Effekte der Aktivierung von Notch1 und der gezielten Inhibition von LSD1 auf die Methylierung an Histon 3 Lysin 4 (H3K4) und H3K9 systematisch zu untersuchen, planen wir die Durchführung von Chromatin-Immunpräzipitationen mit anschließender Sequenzierung (ChIPseq) in Notch1act Mäusen mit und ohne LSD1-Inhibition. Diese Daten sollen mit den Daten aus der RNA-Sequenzierung integriert werden, um Notch1-regulierte Gene zu identifizierten, welche durch Histonmethylierung in Abhängigkeit von LSD1 reguliert werden. Die Ergebnisse werden in humanen Proben mittels ChIP-qPCR in kultivierten Fibroblasten und durch Vergleich der murinen Datensätze mit Datensätzen, welche von verschiedenen SSc-Patienten-Kohorten verfügbar sind, verifiziert. Des Weiteren planen wir, die Anreicherung der pathophysiologisch relevanten Signalwege wie PPAR und MAP Kinase als auch SMAD3/4 im Detail zu analysieren. Hierbei kommen übliche molekularbiologische Techniken wie beispielsweise gezielte molekulare Modulation der Signalweg-Bestandteile mittels siRNA, Expressionsvektoren oder pharmakologische Inhibitoren. Dabei kommen unter anderem analytische Methoden wie Co-Immunpräzipitation (CoIP), Reporter Assays und ChIP-qPCR zum Einsatz. Die in vitro erhaltenen Ergebnisse sollen in vivo durch Inhibition der oben genannten Signalwege in Notch1act Mäusen bestätigt werden. Schließlich wollen wir auch das therapeutische Potential einer LSD1-Inhibition in verschiedenen murinen Modellen experimenteller Fibrose wie z.B. Bleomycin-induzierter Hautfibrose, TSK1 Mäuse und in der chronischen Graft-versus-Host-Erkrankung (cGvHD) evaluieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen