Aufklärung des Weges der Pel-Exopolysaccharid-Sekretion in Pseudomonas aeruginosa: Von der Synthese zum Export

• Antragsteller: Professor Dr. Alexej A. Kedrov
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie ; Biophysik ; Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 468785194

Pseudomonas aeruginosa ist ein opportunistisches Pathogen und ein lebensbedrohlicher Risikofaktor für immungeschwächte Patienten. Seine berüchtigte Virulenz und Antibiotikaresistenz werden durch die Bildung langlebiger Biofilme verstärkt, die es dem Bakterium ermöglichen, mechanischer Belastung und Austrocknung zu widerstehen, und die Besiedlung neuer Gebiete zu fördern. Die Stabilität des Biofilms wird durch seine Matrix vermittelt, die aus den sekretierten Exopolysacchariden (EPS) Alginat, Psl und Pel besteht, die mit extrazellulärer DNA und Strukturproteinen komplexiert sind. Trotz ihrer biomedizinischen Bedeutung gibt es nur wenige molekulare Erkenntnisse über die EPS-Sekretionsmechanismen, und weder ihre Architektur noch ihre funktionelle Dynamik sind bekannt. Ein Verständnis der Sekretionsmechanismen der biofilmbildenden EPS würde neue Ansätze zur Bekämpfung der Ausbreitung von Krankheitserregern ermöglichen und ist daher von höchster biomedizinischer Bedeutung. Wir haben uns vorgenommen, den Biogeneseweg der Pel-EPS aufzuklären, die von P. aeruginosa in frühen Stadien der Biofilmbildung verwendet wird. In der ersten Förderperiode haben wir die hochauflösende Struktur des Außenmembran-Exportkomplexes PelBC in Lipid-Nanodiscs bestimmt und wichtige Fortschritte bei der Untersuchung der aus mehreren Untereinheiten bestehenden Maschinerie PelDEFG erzielt, die für die EPS-Synthese sowie die Translokation durch die innere Membran erforderlich ist. Ein wesentlicher Schritt nach vorn ist nun die Aufklärung der molekularen Mechanismen des Sekretionssystems und die Rekonstruktion des Weges der Pel-EPS durch die Zellhülle. Um diese übergeordneten Ziele zu erreichen, schlagen wir vor, (i) die Pel-Komplexe in verschiedenen Zuständen mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen, um ihre funktionelle Dynamik zu rekonstruieren und die EPS zu verfolgen; (ii) in vitro Assays für die Pel-EPS-Synthese und -Translokation zu etablieren, um den Weg unter maßgeschneiderten und gut kontrollierten Bedingungen zu untersuchen; (iii) Einsatz biophysikalischer Methoden, um die Interaktionen der Pel-EPS mit den Komponenten der Sekretionsmaschinerie zu analysieren und die Bedeutung elektrostatischer Wechselwirkungen bei der Translokation zu ergründen; und (iv) Untersuchung der Kopplung der Pel-Komplexe in den inneren und äußeren Membranen sowie der Rolle der naszierenden EPS beim Zusammenbau. Die vorgeschlagene biochemische, biophysikalische und strukturelle Analyse der Pel-Maschinerie, ergänzt durch Molekulardynamiksimulationen und In-vivo-Untersuchungen der Biofilmbildung von P. aeruginosa, die im Rahmen der Zusammenarbeit vorgesehen sind, sollte zu einem umfassenden Verständnis des für die Pathogenität relevanten und weit verbreiteten EPS-Sekretionssystems führen und somit von hoher Relevanz für die Mikrobiologie und die Molekularmedizin sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen