Strukturelle und funktionale Organisation Ebola Virus induzierter zytoplasmatischer Einschlusskörperchen (inclusion bodies)

• Antragstellerin: Dr. Melina Vallbracht
• Fachliche Zuordnung: Virologie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 469065579

Ein Hauptmerkmal von Infektionen, die durch das zoonotische Ebola Virus (EBOV) und andere Vertreter der Filoviren verursacht werden, ist die Bildung membranloser Einschlusskörperchen, sogenannter ‚inclusion bodies‘ (IBs) im Zytoplasma der infizierten Zelle. Bei diesen hochspezialisierten viralen Strukturen handelt es sich um die Replikationszentren, in denen wichtige Prozesse wie die Replikation und Transkription des viralen RNA-Genoms stattfinden. Obwohl IBs eine essentielle Rolle für den Replikationszyklus des EBOVs spielen, ist der strukturelle und funktionale Aufbau dieser Organellen weitestgehend unbekannt. Ein tiefergehendes Verständnis ist jedoch von zentraler Bedeutung für die Entwicklung neuer und wirksamer antiviraler Strategien. Das Ziel dieses Forschungsvorhabens ist die detaillierte strukturelle Charakterisierung EBOV induzierter IBs. Mithilfe hochauflösender on-lamella Kryo-elektronentomographie (Cryo-ET) in Kombination mit korrelativer Kryo-Licht Mikroskopie soll erstmals die molekulare 3D Struktur von EBOV IB Populationen in ihrer nativen, zellulären Umgebung charakterisiert werden. Das Forschungsvorhaben soll insbesondere drei zentrale, bisher ungeklärte Hypothesen und Fragen in Bezug auf EBOV IBs ergründen. 1) Da in IBs unterschiedliche virale Prozesse wie Replikation, Transkription, Zusammenbau und Reifung des viralen Nukleokapsids stattfinden gehen wir davon aus, dass IBs hochorganisierte Strukturen sind, die möglicherweise Subkompartimente bilden, um die unterschiedlichen Prozesse effizient zu koordinieren. Unsere Untersuchungen sollen Aufschluss über die strukturelle und funktionale Organisation der IBs geben. Mithilfe fluoreszenz-gekoppelter viraler Proteine, die in den IBs akkumulieren sowie einer neuen Methode, die es ermöglicht RNA in lebenden Zellen zu visualisieren können die IBs in infizierten Zellen lokalisiert und anschließend hochauflösend mittels cryo-ET analysiert werden. 2) Das derzeitige Modell der EBOV Replikation geht davon aus, dass lediglich kondensierte Nukleokapside aus IBs ausgeschleust und intrazellulär transportiert werden. Der genaue Ablauf dieser Assemblierungs-Kaskade und insbesondere intermediäre Nukleokapsid-Strukturen innerhalb der Zelle sind bislang noch unbekannt. Mithilfe von in cellulo Cryo-ET sollen die unterschiedlichen Stadien und somit die Reifung des Nukleokapsids charakterisiert werden. Dabei wird insbesondere die Rolle der viralen Proteine (VP)24 und VP40 für die Nukleokapsidkondensierung genauer untersucht werden. 3) Der molekulare Mechanismus des Austritts der Nukleokapside aus den IBs ist bisher noch ungeklärt. Ziel ist die strukturelle Untersuchung dieses Prozesses. Die zentralen Fragen sind, ob Nukleokapside in einer bestimmten Orientierung aus den IBs ausgeschleust werden, ob ausschließlich kondensierte Nukleokapside transportiert werden und ob Komponenten des Zytoskeletts an dem Austrittsprozess beteiligt sind.

• DFG-Verfahren: WBP Stelle