Hybrid-LC-MS/MS-ESI-Massenspektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das mit einer nano-UPLC-Anlage gekoppelte Orbitrap XL Massenspektrometer wird von der zentralen Serviceeinheit des Life Science Centers (LSC) der Universität Hohenheim betrieben und vorwiegend im Rahmen von Serviceanalysen für Nutzer der Universität Hohenheim sowie in Verbundprojekten mit Hohenheimer Beteiligung eingesetzt. Die mit dem Gerät durchgeführten Analysen umfassen die Identifizierung von Proteinen aus 1D-, 2D- und 2D-DIGE-Gelen, die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen in komplexen Gemischen sowie die Identifizierung und Quantifizierung von posttranslationalen Proteinmodifikationen (Phosphorylierung, Glykosylierung). Neben Serviceanalysen werden in der Serviceeinheit des LSC auch eigene Forschungsprojekte durchgeführt, in denen das Gerät eingesetzt wird. In einem vom BMBF unter Federführung der BASF SE geförderten Projekt werden quantitative Proteomanalysen des Bakteriums Pseudomonas putida durchgeführt, um die Auswirkung verschiedener Solventien in biotechnologischen Prozessen zu untersuchen. Dabei wird das Orbitrap XL Massenspektrometer für die Identifizierung von Proteinen aus 2D-DIGE Gelen sowie für eine labelfreie quantitative Analyse von Membranproteinen eingesetzt, die sich nicht über 2D-Elektrophorese/2D-DIGE untersuchen lassen. Die hohe Auflösung und Massengenauigkeit der Orbitrap XL ist auch von großem Vorteil für eine detaillierte Charakterisierung von Peptiden in komplexen Gemischen. Diese Vorzüge werden in einem lebensmitteltechnologischen Projekt, in dem der Fokus auf der gezielten Modifikation und enzymatischen Spaltung von Milchproteinen liegt, genutzt. Ziel ist es, Peptidfraktionen mit definierter Aminosäurezusammensetzung („bioaktive Peptide“) aus Milchproteinhydrolysaten zu erhalten. In einem weiteren Projekt wurden Phosphorylierungsstellen eines am Sehprozess in Drosophila melanogaster beteiligten Ionenkanals zunächst identifiziert und anschließend die lichtabhängige Phosphorylierung mit Hilfe einer labelfreien nano-LC-MS-Methode quantifiziert. Insgesamt konnten mit dieser Methode 21 Phosphorylierungsstellen identifiziert werden und ihre lichtabhängige Regulation quantitativ erfasst werden. Neben Proteinphosphorylierung wurden mit dem Orbitrap XL-Massenspektrometer auch die Glykosylierung von Proteinen untersucht. Dabei gelang es, verschiedene Glykosylierungsstellen einer Subtilase und eines Dirigent-Proteins aus Tomate zu identifizieren und die verschiedenen Glykoformen der beiden Proteine zu charakterisieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2009). Flavonoid glucuronides and a chromone from the aquatic macrophyte Stratiotes aloides. J. Nat. Prod. 72(5), 835-840
Conrad J., Förster-Fromme B., Constantin M.A., Ondrus V., Mika S., Mert-Balci F., Klaiber I., Pfannstiel J., Möller W., Rösner H., Förster-Fromme K., Beifuss U.
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(2009). Mimicking Ndc80 phosphorylation triggers spindle assembly checkpoint signalling. EMBO J., 28(8), 1099-1110
Kemmler S., Stach M., Knapp M., Ortiz J., Pfannstiel J., Ruppert T., Lechner J.
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(2009). The protease-associated domain and C-terminal extension are required for zymogen processing, sorting within the secretory pathway, and activity of tomato subtilase 3 (SISBT3). J. Biol. Chem. 284,14068-14078
Cedzich A., Huttenlocher F., Kuhn B.M., Pfannstiel J., Gabler L., Stintzi A., Schaller A.
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(2010). An enantiocomplementary dirigent protein for the enantioselective laccase-catalyzed oxidative coupling of phenols. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49(1), 202-204
Pickel B., Constantin M.A., Pfannstiel J., Conrad J., Beifuss U., Schaller A.
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(2010). Light-dependent phosphorylation of the drosophila transient receptor potential ion channel. J.Biol. Chem., 285(19), 14275-14284
Voolstra O., Beck K., Oberegelsbacher C., Pfannstiel J., Huber A.
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(2010). Tandem affinity purification combined with inducible sh-rna expression as a tool to study the maturation of macromolecular assemblies. RNA 17(1),189-200
Wyler E., Zimmermann, M., Widmann, B., Gstaiger, M., Pfannstiel, J., Kutay, I., Zemp, I.
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(2011). Protein kinase CK2 links polyamine metabolism to MAPK signalling in Drosophila. Cell Signal. 23(5), 876-882
Stark F., Pfannstiel J., Klaiber I., Raabe T.
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(2011). The nucleotide sequence and genome organization of Plasmopara halstedii virus. Virol. J., 8,123
Heller-Dohmen M., Göpfert J.C., Pfannstiel J., Spring O.
