Untersuchungen zur Rolle von Keratinozyten in peripheren Toleranzmechanismen und der Auslösung muriner Graft-versus-Host-Disease
Final Report Abstract
K14-sOVA transgene Mäuse (sOVA) exprimieren unter der Kontrolle des Keratin-14- Promotors lösliches Hühnerovalbumin (OVA) als körpereigenes Eiweiß (Selbstantigen) in der Haut, Zunge, Ösophagus, Leber und Thymus. Um ein spontanes Modell der Autoimmunität zu generieren wurden sOVA Mäuse mit OT-I Mäusen, deren CD8 T Zellen einen transgenen T Zell Rezeptor (TZR) mit Spezifität für das OVA257-264-Peptid tragen, verpaart. OT-I CD8 T Zellen können mittels monoklonaler Antikörper gegen die Vα2- und Vβ5-Ketten des TZR identifiziert, und auf Einzelzellebene analysiert werden. 80% der neugeborenen sOVA/OT-I Mäuse verstarben in der 3. Lebenswoche an einer generalisierten Autoinflammation OVA- positiver Organe. 20% überlebten diese Periode spontan und entwickelten im Alter von ca. 8 Wochen Hautläsionen die der Graft-versus-Host-Disease (GvHD) gleichen. Durch prophylaktische Injektionen von OVA257-264 am 5. und 9. Lebenstag erreichten 98% der Neugeborenen sOVA/OT-I Mäuse ohne Krankheitszeichen das Erwachsenenalter, entwickelten jedoch ebenso wie spontane Überlebende im weiteren Verlauf eine GvHD- ähnliche Erkrankung. Therapeutische OVA257-264-Injektionen in akut erkrankten, nicht vorbehandelten, sOVA/OT-I Jungtieren retteten 66% der Mäuse. Die Untersuchung spontan gesunder bzw. gesunder Peptid-behandelter (prophylaktisch oder therapeutisch) sOVA/OT-I Mäuse führte zur Identifikation verschiedener neuer bzw. bisher wenig beachteter Toleranzmechanismen von CD8 T Zellen: (I.) Herunterregulierung des CD8-Korezeptors (CD8-tuning mit reduzierter Aktivierung der CD8 T Zellen aufgrund verminderter Stabilisierung von Peptid-MHC-I-TZR Komplexen und verminderter Signaltransduktion durch das CD8 Molekül). (II.) Heruterregulation der Vα-Kette des TZR, wodurch eine Aktivierung der CD8 T Zelle durch den spezifischen Liganden ihres TZR nicht mehr möglich ist. (III.) Fehlende Aktivierung, Proliferation sowie reduzierte Produktion von Effektorzytokinen der CD8 T Zellen nach Antigen-spezifischer Stimulation, bzw. auch nach direkter Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden durch PMA/Ionomycin. Diese “Anergie” war nicht durch Interleukin 2 (IL-2) zu brechen, was im Gegensatz zur klassischen Anergie von T Zellen steht. (IV.) Fehlende Regulation der CD8-Expression durch IL-2 und IL-7. Die Untersuchung des gemeinsamen STAT5 Signaltransduktionswegs belegte eine Blockade im “STAT5- signaling” von CD8 T Zellen von gesunden sOVA/OT-I Mäusen, wodurch sowohl deren niedrige CD8-Expression, IL-2-refraktäre Anergie sowie eine Produktion von Effektorzytokinen erklärt werden kann (TNF-α, IFN-γ, Th17). Sowohl das CD8-tuning als auch ein Block in der Signaltransduktion von „common-γ-chain“-Zytokinen (IL-2, -4, -7, -15, -21) wurden bisher noch nicht als Mechanismen induzierter T Zell Toleranz im Rahmen von Krankheitsmodellen beschrieben. Ein weiteres interessantes Ergebnis ist die Beobachtung hochreaktiver dual Rezeptorpositiver CD8 T Zellen in kranken sOVA/OT-I Mäusen. Dual TZR T Zellen wurden bislang als Auslöser von Autoimmunerkrankungen diskutiert. Wir konnten hier erstmals einen starken Hinweis für eine pathogenetische Rolle von dual TZR CD8 T Zellen in vivo belegen. Zukünftige Studien im sOVA/OT-I Modell sollen das Genexpressionsmuster von tolerisierten versus aktivierten CD8 T Zellen vergleichen und so einen genetischen “Toleranzfingerabdruck” generieren. Hieraus können Zielstrukturen für pharmakologische Inhibition (z.B. Kinaseinhibitoren, RNA-Interferenz) von T Zellen identifiziert werden. In komplementären Untersuchungen auf der Proteinebene soll die Funktionalität von Schlüsselmolekülen für die Toleranzinduktion in (CD8) T Zellen bzw. deren Aktivierung analysiert werden (Phosphorylierungsstudien, Ubiquitinylierung, etc.). Insbesondere die Analyse der Signaltransduktion von (common-γ-chain) Zytokinen ist hier von Interesse (z.B. Expression und Funktionalität der α, β, γ-Ketten, Janus Kinasen, etc.). Weitere Studien sollen das Zusammenspiel der CD8 T Zellen mit antigen-präsentieren Zellen (B Zellen, Dendritische Zellen) oder NK Zellen im Rahmen der Toleranzinduktion analysieren. Derzeit werden sOVA/OT-I Mäuse in der Quarantäne Sektion der Abteilung für Vergleichende Medizin des Helmholtz Zentrums München expandiert. Nachfolgend werden diese in die Tierhaltung der Klinischen Kooperationsgruppe Umweltdermatologie und Allergologie Helmholtz Zentrum München/TUM mittels Embryonentransfers überführt.
Publications
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Self-peptides prolong survival in murine autoimmunity via reduced IL-2/IL-7 mediated STAT5-signaling, CD8- coreceptor- and Vα2-downregulation. J Immunol. 183:3130-3138; 2009
Gutermuth J, Nograles K, Miyagawa F, Nelson E, Cho YH, Katz SI
