Verbesserung der Präzision von CRISPR-Cas9 durch niedermolekulare Modulatoren: Mechanistische Einblicke und Entdeckung neuer Wirkstoffe

• Antragsteller: Dr. Xinlai Cheng
• Fachliche Zuordnung: Pharmazie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 491581972

Die CRISPR-Cas9-Technologie zur Genomeditierung hat die Biologie und Medizin grundlegend verändert und eröffnet bisher ungeahnte Möglichkeiten zur präzisen genetischen Manipulation. Dennoch bleibt ihre klinische Anwendung durch ungewollte Off-Target-Effekte, immunogene Risiken und hohe Behandlungskosten eingeschränkt. Daher besteht dringender Bedarf an Strategien, welche die Spezifität, Sicherheit und Bezahlbarkeit von CRISPR-Therapien verbessern. In der laufenden Förderperiode haben wir robuste biochemische, biophysikalische und zellbasierte Assays etabliert, um kleine Moleküle zu identifizieren und zu charakterisieren, die Cas9 modulieren. Mithilfe unserer optimierten thermischen Stabilitätsassays konnten wir mehrere potente Cas9-Modulatoren entdecken. Durch die Kombination von KI-gestützten Strukturmodellen und experimentellen Validierungen mittels biochemischer Assays, Strukturbiologie und zellulärer Reporter-Systeme konnten wir zeigen, dass mehrere pflanzliche Naturstoffe spezifisch an die Bridge-Helix/REC1-Schnittstelle von Cas9 binden, wodurch Off-Target reduziert werden, während die präzise Editing erhalten bleibt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass bestimmte bereits FDA-zugelassene Medikamente Cas9 stabilisieren, indem sie an die REC3-Domäne binden, was die Editing Genauigkeit zusätzlich erhöht. Diese Ergebnisse wurden auf renommierten internationalen Tagungen präsentiert, und mehrere Manuskripte sowie Patentanmeldungen befinden sich aktuell in Vorbereitung. In der beantragten Fortsetzungsförderung wollen wir unser mechanistisches Verständnis dieser Modulatoren vertiefen und weitere neuartige kleine Moleküle identifizieren, die Präzision und Effizienz von Cas9 weiter verbessern. Dazu verfolgen wir zwei zentrale Arbeitspakete: (1) detaillierte strukturelle und funktionelle Analysen der vielversprechendsten Leitverbindungen mittels hochauflösender Kristallographie, Kryo-Elektronenmikroskopie und umfassender biochemischer Assays sowie (2) erweiterte Hochdurchsatz-Screenings von umfangreichen Naturstoff- und makrozyklischen Substanzbibliotheken mit anschließender rigoroser, mehrstufiger Validierung. Die besten Kandidaten aus diesen Screenings werden systematisch charakterisiert, einschließlich SPR, EMSA, FP, zellulärer Editing Assays und umfassender, Sequenzierungs-basierter Spezifitätsanalysen (Amplicon-Seq, GUIDE-Seq, Circle-Seq). Durch diese integrierten Ansätze erwarten wir definitive Einblicke in die Interaktion zwischen kleinen Molekülen und Cas9, klare Struktur-Wirkungs-Beziehungen und die Identifikation von Leitverbindungen, die für die präklinische Entwicklung geeignet sind. Letztendlich wird dieses Fortsetzungsprojekt chemische Strategien zur präzisen Genomediting entscheidend voranbringen und so den Weg für sicherere, effektivere und zugänglichere CRISPR-basierte Therapien ebnen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen