Beobachtung von aktivem Membrantransport und ATP Hydrolyse mit Einzelmolekülsensitivität

• Antragsteller: Professor Dr. Thorben Cordes
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 494983708

Aktive Membrantransporter sind an einer Vielzahl von essentiellen zellulären Prozessen beteiligt. Sie sind daher die Ursache von verschiedenen Erkrankungen, bakterieller Pathogenität oder auch Arzneimittelresistenzen und stellen somit wichtige Ziele für Therapien bzw. deren Erforschung dar. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Transporter identifiziert und es konnte auch ihre dreidimensionale Struktur aufgeklärt werden. Dies war ein wichtiger Schritt für die Entwicklung neuer Wirkstoffmoleküle und Therapien. Leider sind diese Strukturen statisch und können nur begrenzte Einblicke in Transportmechanismen liefern. Ein wichtiger nächster Schritt zu einem besseren Verständnis derselbigen könnte durch die (gleichzeitige) Beobachtung von Transportkinetik, Energieverbrauch und struktureller Dynamik erreicht werden. Solch eine Strategie wurde bereits für die Untersuchung von Ionenkanälen durch eine Kombination von elektrophysiologischer und optischer Meßmethodik realisiert. Für Transporter jedoch, die oft nicht geladene Substrate sehr langsam durch die Membran schleußen, kann ein ähnliches Verfahren nicht eingesetzt werden. Ziel dieses Antrags ist es eine Methode zur Beobachtung von Transport- und Energieumwandlungsprozessen von einzelnen ABC-Transportern zu entwickeln. Hierfür soll sensitive Videomikroskopie in Kombination mit Fluoreszenzsensoren verwendet werden. Diese neuartige Technik liefert einen direkten Zugang zu biochemischen Informationen einzelner Transporter, d.h. Transportraten, funktioneller Dynamik (An/Aus-Perioden) bzw. auch den Unterschieden zwischen einzelnen Transportern. Die folgenden Fragestellungen sollen in diesem Antrag bearbeitet werden:Arbeitspaket 1: Entwicklung und Charakterisierung von Fluoreszenzsensoren für verschiedene ABC-Transporter zur Beobachtung von Substrattransport, ATP-Hydrolyse und Energiekopplung.Arbeitspaket 2: Etablierung von Einzeltransporteruntersuchungen mit dem Ziel funktionale Dynamik über die Zeit zu verfolgen oder generelle Unterschiede zwischen einzelnen Transportern zu beobachten. Die biochemische Kinetik (anfängliche Transportrate und die Rate der ATP Hydrolyse) von ausgesuchten ABC Transportermodellen soll durch gleichzeitige Messung der Liposomengröße quantifiziert werden.Arbeitspaket 3: Wir werden verschiedene mechanistische Fragen mit dem neuen Untersuchungsverfahren bearbeiten. Dabei werden sollen als erstes Unterschiede zwischen Ensemble und Einzeltransporter-Experimenten untersucht werden. Dann werden wir den Einfluss katalytischer NBD-Mutationen und den Einfluss unterschiedlicher Substrate auf die Energiekopplungseffizienz charakterisieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen