Flavin-abhängige Halogenasen – Von der Cofactor-Regenerierung bis zu komplexen Substraten

• Antragsteller: Professor Dr. Tilman Kottke; Professor Dr. Hartmut Niemann; Professor Dr. Norbert Sewald
• Fachliche Zuordnung: Biologische und Biomimetische Chemie ; Biochemie ; Physikalische Chemie von Molekülen, Flüssigkeiten und Grenzflächen, Biophysikalische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 503112002

Flavin-abhängige Halogenasen (FDHs) benötigen zur Halogenierung ihrer Substrate nur Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Sauerstoff und Halogenidsalze und bieten somit einen äußerst attraktiven biokatalytischen Zugang zu halogenierten Verbindungen mit hoher Regioselektivität. Das gemeinsame Projekt wird sich darauf konzentrieren, grundlegende Struktur-Funktions-Beziehungen zu etablieren, um Halogenasen in Hinsicht auf Aktivität, Stabilität und Substratbreite zu verbessern. Dies wird zu einem tieferen Verständnis des zugrunde liegenden Mechanismus und der entscheidenden Parameter für die selektive C-H-Aktivierung wie Substratbindung und -erkennung sowie Cofaktorregenerierung führen.Biokatalysatoren, die aromatische Aminosäuren (Trp) in Peptiden halogenieren können, werden entwickelt, um Peptid- und möglicherweise sogar Proteinhalogenierung zu ermöglichen. Zu diesem Zweck werden Arrays von Peptiden mit Tryptophan in unterschiedlichen Positionen synthetisiert, einer enzymatischen Halogenierung unterzogen und aktive Halogenasen in Evolutionskampagnen verbessert. Kristallstrukturen werden die strukturelle Basis der Peptidbindung im aktiven Zentrum aufdecken. Anhand dieser Strukturen werden wir der Frage nachgehen, warum nur bestimmte Halogenasen große Substrate effizient umsetzen.Ein zweiter Schwerpunkt des Projekts wird die Cofaktorregenierung sein. Der Cofaktor FAD muss in seinem voll reduzierten Zustand (FADH2) vorliegen, um im ersten katalytischen Schritt mit Sauerstoff zu reagieren. Eine große Herausforderung bei allen Regenerierungsmethoden ist die Entkopplung. Freies FADH2 reagiert mit Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid, anstatt an das Enzym zur Katalyse zu binden. Unser Ziel ist es, das enzymgebundene FAD direkt photochemisch zu reduzieren, um eine Entkopplung zu vermeiden und dadurch die Halogenase in ein effizientes lichtgetriebenes Enzym umzuwandeln. Wir werden die Herausforderung der FAD-Bindungsaffinität angehen, indem wir eine kovalente Bindung an das FAD einführen. Darüber hinaus wird grundlegend geklärt, ob FAD enzymatisch regeneriert werden kann, während es an die Halogenase gebunden ist, oder ob ein Teil oder das gesamte FAD von der Halogenase dissoziieren muss, um durch eine Flavinreduktase in FADH2 umgewandelt zu werden.Zusammenfassend planen wir, die Anforderungen von Halogenasen für die Aufnahme von Trp-haltigen Peptiden als Substrate aufzudecken. Wir werden auch Faktoren, die Thermostabilität verleihen, von Faktoren unterscheiden, die die Aktivität beeinflussen, und den Mechanismus der Cofaktorregenerierung analysieren, um direkte Verbesserungen der Halogenierungseffizienz zu erzielen. Darüber hinaus werden wir klären, ob eine dynamische oder kovalente Bindung des Cofaktors für die Katalyse von Vorteil ist und den Einfluss der Proteinflexibilität auf Substratbindung und Umsatz untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen