Molecular mechanism of protein degradation by Tripeptidyl Peptidase II (TPPII)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Antragszeitraum haben wir die Struktur und Funktion der Tripeptidyl Peptidase II (TPPII) untersucht, der größten bekannten eukaryontischen Protease. TPPII spaltet Tripeptide von den N-Termini längerer Peptide ab und spielt zudem eine wichtige Rolle in vielen Prozessen der Zelle. Vor einiger Zeit konnten wir zeigen, dass Drosophila TPPII ein 40-mer aus 150 kDa-Untereinheiten ist, welche zu einem großen, spindelförmigen Komplex assembliert sind und dass die spezifische Aktivät mit der Anzahl assemblierter Dimere ansteigt, was auf einen Aktivierungsmechanismus schließen lässt der auf Dimer-Dimer Kontakten beruht. Durch die Kombination von Einzelpartikelkryomikroskopie von TPPII Spindeln und Röntgenkristallographie von TPPII-Dimeren, haben wir nun eine Hybridstruktur des TPPII Komplexes erhalten. Die Struktur zeigt, dass die aktiven Zentren von TPPII in einem Kavitätensystem eingeschlossen sind, das nur durch enge Öffnungen zugänglich ist. Die Struktur verdeutlicht außerdem, auf welchem Weg ein Substrat zu den aktiven Zentren gelangen kann. Zudem ließ sich daraus ein Modell für den Mechanismus ableiten nach dem die Aktivierung durch Assemblierung erfolgen könnte. Hierbei spielt die Umlagerung einer flexiblen Loopregion eine Rolle, die mit dem Serinrest des aktiven Zentrums verknüpft ist. Im Antragszetraum haben wir auch eine Expressions- und Reinigungsstrategie für humanes TPPII entwickelt und ein erstes 3D Modell mittels Kryoelektronenmikrosopie und Einzelpartikelanalyse erhalten. Um unsere Hypthese, dass die große Oberfläche von TPPII auch für Protein-Protein- Interaktionen von Bedeutung ist, zu testen, haben wir Interaktionsstudien durchgeführt. Dabei haben wir eine Liste potentiell interagierender Proteine erhalten, die es nun zu bestätigen gilt. Um TPPII im zellulären Kontext zu visualisieren, haben wir begonnen, Tomogramme von Kryoschnitten von Drosophila Zellkulturen aufzuzeichnen. Im Verlauf des Projektes wurde deutlich, dass die Anwesenheit einer TPPII-Spindel in einer Rekonstruktion keineswegs selbstverständlich ist. Eine Möglichkeit diese Anwesenheit sicherzustellen, wäre die korrelative Mikroskopie, bei der die für die Tomographie interessanten Zellareale anhand ihrer Fluoreszenz ausgewählt werden. Die Schwierigkeit hier besteht momentan darin, einen Fluoreszenzmarker für TPPII zu finden, der die Bildung des Komplexes nicht behindert.
