LC-ESI-MS/MS Massenspektrometer
Final Report Abstract
Phospholipide (PL) und ihre Vorstufen stellen wichtige Analyte unserer Projekte zum pulmonalen Surfactant, hepatischen Lipidstoffwechsel und Cholinmangel bei Frühgeborenen und Mukoviszidose (CF) dar. Molekulares Profil und Metabolismus der PL sind funktionsrelevant & organotypisch verschieden und differieren krankheits-, interventions- & entwicklungsbedingt. An unserem LC-MS/MS wurden daher Methoden zur Untersuchung von Homöostase und Metabolismus endogener und mit stabilen Isotopen markierter Phospholipide in vivo & in vitro etabliert. Damit sollten sowohl Radioisotope vermieden als auch direkte Stoffwechseluntersuchungen an Patienten durchführbar werden. Hauptadressate sind Cholin und seine Abbau- & Syntheseprodukte, d.h. Betain, Phosphocholin, Sphingolipide (SPH), Phosphatidylcholine (PC) und Lyso-PC-Derivate. Für metabolische Untersuchungen wurde die stabile Isotopen-Markierung in vivo etabliert und die zugehörige Analytik aufgebaut. [D9-Methyl]cholin stellte sich als vorteilhafter Prekursor bei Versuchstieren und Patienten in vivo dar. Damit wurde es möglich die Kinetiken von Cholin und seinen wasserlöslichen Derivaten sowie die Neusynthese und Sekretion von PC via Kennedy-Pathway (M+9- Derivate) und via hepatischen Methylierungspathway (PEMT-Pathway; M+3- & M+6-Derivate) zu bestimmen. Während absolute Synthese und Sekretionsraten des PEMT-Pathways aus dem M+6/M+3-Verhältnis errechnet werden können, mussten für den Kennedy-Pathway und die Präkursoren-Kinetik LC-Verfahren für markiertes und unmarkiertes Cholin und seine Derivate (Betain, Phosphocholin etc.) entwickelt werden. Für die Quantifizierung der weit über 100 SPH-, PC-, Lyso-PC- und wasserlöslichen Cholin-Metabolite wurden Excel-basierte Makros zur Korrektur von Ionisierungsunterschieden, Isotopenkorrektur („C13-Effekt“) und Masseninterferenzen der Einzelanalyte erstellt. Darauf basierend wurde das experimentelle und analytische Design unserer Projekte zunehmend von der HPLC- auf die LC-MS/MS-Analytik umgestellt und folgende Projekte adressiert: • Entwicklungsphysiologie, Mechanismen und funktionelle Konsequenzen lipidomischer Veränderungen des Surfactants (DFG-Projekt). •Therapeutische Wirkungen des rekombinanten anabolen Keratinocytenwachstumsfaktors (rhKGF) (1) bei Störungen der Surfactanthomöostase durch Lungenunreife und Hyperoxie sowie (2) im Vergleich zu dem katabolen Glucocorticoid Betamethason an der neonatalen Ratte. Insbesondere wurden nicht nur die pulmonalen, sondern auch die systemischen Effekte (Leber, Plasma) auf die Lipidhomöostase untersucht. •Der aufgrund einer Analyse interner Ernährungsprotokolle vermutete Cholinmangel sehr kleiner (<1500 g) Frühgeborener mündete in einem Projekt zur Untersuchung der Cholinspiegel und der für die neurale Entwicklung essentiellen polyunsaturierten PC-Spezies (PUFA-PC) im Plasma solcher Patienten. In Folge unserer Ergebnisse prüfen wir derzeit, ob Frühgeborene eine Supplementierung mit Cholin benötigen, da es essentieller Precursor für die hepatische PC-Synthese, den postnatalen Anabolismus aller Gewebe und hauptsächlicher Carrier von Docosahexaensäure für die ZNS-Versorgung ist. • Da der PEMT-Pathway für die periphere Versorgung mit Docosahexaen- & Arachidonsäure in Form von PUFA-PC wesentlich ist (Gemeinschaftsprojekt mit Prof. A. D. Postle, Universität Southampton, UK), wurde der Effekt von rhKGF auf diesen Stoffwechselweg an neugeborenen Ratten untersucht. Zudem wurde begonnen, in diesem Tiermodell den Einfluß von Estradiol in vivo auf den hepatischen PEMT-Pathway zu untersuchen, da in vitro die PEMT östrogenabhängig ist. •Steatosen und Steatohepatitiden sind teilweise durch einen Cholinmangel erklärbar. In einem Pilotprojekt mit [D9-Methyl]cholin-Infusion in vivo bei Mukoviszidose (CF)-Patienten mit Leberbeteiligung wurden die Plasmakinetiken von [D9-Methyl]cholin & seinen wasserlöslichen Derivaten sowie die hepatische Synthese und Sekretion von PC untersucht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, daß die CF-Leber wegen eines Cholinmangels vermindert PC (als Lipoproteinbestandteil) in das Plasma sezerniert. Sie implizieren weitere Untersuchungen zur Cholin- und PC-Homöostase mittels [D9-Methyl]cholin-Markierung & MS/MS-Analytik bei Patienten mit gestörter hepatischer Lipidhomöostase. Diese Untersuchungen wurden u. a. flankiert durch Plasmauntersuchungen der Phospholipid- und Cholin-Homöostase bei Erwachsenen mit unterschiedlichen Lipid-Diäten (Prof. Dr. Andreas Fritsche & Dr. M. Heni, Abt. Innere Medizin IV, Univ. Tübingen).
Publications
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2010. Myristate is selectively incorporated into surfactant and decreases dipalmitoylphosphatidyl-choline without functional impairment. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299:R1306-1316
Pynn CJ, Picardi MV, Nicholson T, Wistuba D, Poets CF, Schleicher E, Perez-Gil J, Bernhard W
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2011. Increased palmitoyl-myristoyl-phosphatidylcholine in neonatal rat surfactant is lung specific and correlates with oral myristic acid supply. J Appl Physiol. 111: 449-457
Bernhard W, Raith M, Pynn CJ, Gille C, Stichtenoth G, Stoll D, Schleicher ED, Poets CF
