Regulierung der Translationsinitiierung durch nichtkodierende RNAs von Mycobacterium tuberculosis auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit

• Antragsteller: Dr. Olivier Duss, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Biophysik ; Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 512397425

Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb) sind die häufigste Todesursache, die auf ein einzelnes Pathogen zurückzuführen ist. Ein großes Problem bei der Behandlung von Mtb ist sein einzigartiger Lebenszyklus mit zwei verschiedenen Stoffwechselzuständen: einem aktiven, sich replizierenden Krankheitszustand und einem latenten Zustand. Im letzteren Zustand ist die Proteinsynthese global herunterreguliert, so dass die Bakterien weniger empfindlich auf Antibiotika reagieren. Nichtkodierende RNAs (in Bakterien als kleine RNAs, sRNAs, bezeichnet) können den Eintritt und die Aufrechterhaltung dieses Ruhezustands regulieren und sind auch an der aktiven Tuberkulosis-Infektion beteiligt. sRNAs können in verschiedenen Stadien der Genexpression wirken und dienen als globale Regulatoren der Genexpression. Jedoch ist wenig erforscht wie sRNAs von Mtb im molekularen Level funktionieren. Im Rahmen dieses Vorschlags werden wir eine in vitro Mehrfarben-Einzelmolekül-Plattform für die Echtzeitverfolgung der kotranskriptionellen Translationsinitiierung einrichten, die durch Mtb sRNAs reguliert wird und diese Daten mit in vitro und vivo funktionalen Assays validieren. Durch die Verfolgung einzelner mRNA-Moleküle können wir sehen, wie die Transkription, die kotranskriptionelle Faltung, die Interaktion mit sRNAs und der Beginn der Translationsinitiierung in Echtzeit erfolgen und zueinander funktional gekoppelt sind. Unser erstes Ziel in diesem Projekt ist die Etablierung einer Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie-Plattform für die Echtzeit-Verfolgung der kotranskriptionellen Translationsinitiierung von Mtb. Um dies zu erreichen, werden wir 1) einen Assay zur Überwachung der Transkription unter Verwendung von Mtb RNA Polymerasen in Echtzeit entwickeln, 2) Mtb 30S ribosomale Untereinheiten in vitro rekonstituieren und markieren und 3) einen integrierten Assay zur gleichzeitigen Echtzeitüberwachung der Transkription, der mRNA-Faltung und der Translationsinitiierung entwickeln, um zu verstehen, wie die Struktur der mRNA die Dynamik der Translationsinitiierung beeinflusst. Das zweite Ziel dieses Projekts besteht darin, die molekularen Mechanismen der Regulierung der Translationsinitiation durch die 6C sRNA als Modelsystem zu untersuchen. Hier werden wir 1) untersuchen, wie die Bindungsdynamik der 6C sRNA die Effizienz der Translationsinitiierung verschiedener mRNAs reguliert und 2) untersuchen, wie andere Faktoren die Funktion der 6C sRNA beeinflussen (z.B. RNA-Chaperone, Antisense-Oligos).Diese Einzelmolekülplattform, die etablierten Methoden und entwickelten Konzepte werden weitere Studien zum bisher wenig erforschten Kontext der kotranskriptionellen mRNA-Strukturbildung ermöglichen und erklären wie dynamische RNA-Struktur zelluläre Signale einbezieht, um sie in einen spezifischen zellulären Output umzuwandeln. RNA ist dynamisch und heterogen und daher schwer zu untersuchen, und dieser Vorschlag wird Methoden liefern, um diese Herausforderungen zu bewältigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen