Hochdurchsatz-Peptidinteraktionsentdeckung, Epitopmarkierung und gesplittete Näherungskennzeichnungsmethoden
Biologische und Biomimetische Chemie
Organische Molekülchemie - Synthese, Charakterisierung
Pharmakologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In menschlichen Zellen stammt fast ein Viertel der aktiv übersetzten Peptide von bisher nicht annotierter langer nichtkodierender RNA, deren funktionelle Rolle nicht bekannt ist. Darüber hinaus ist die Rolle kurzer Peptide, die durch die Reifung von Proteinen entstehen, die aus kanonischen Genen translatiert werden, noch weitgehend ungeklärt. Dieser weitgehend ungezähmte Mikrokosmos bietet ein ungenutztes Potenzial für die Entwicklung neuer pharmakologischer Ziele und das Verständnis der zugrunde liegenden Biologie. Unser Ziel war es, diese unerforschten Interaktionen mit Hilfe der photokatalytischen Technologie der Proximity-Markierung (μMap) zu untersuchen, um im Hochdurchsatzverfahren Proteininteraktoren zu entdecken und gemeldete, aber kryptische Peptide mit 20-100 Aminosäuren zu lokalisieren. Ursprünglich wollten wir die affinitätsbasierte Isolierung markierter Peptide mit reversibler Desthiobiotin (DTB)/Streptavidin-Bindung nutzen, aber eine erste Bewertung dieses Ansatzes ergab unüberwindbare Herausforderungen: (1) endogener Biotin-Hintergrund, (2) erforderlicher großer Materialeinsatz, (3) wochenlange Probenverarbeitung, (4) Kosten für Streptavidin-basierte Sorptionsmittel. Wir vermuteten, dass im Vergleich zur Flüssigphasen-Affinitätsanreicherung von Peptiden vor der MS-Analyse ein Gasphasen- Anreicherungsansatz für ionisierte Peptide (1) die Probenverarbeitung minimieren, (2) verdünnte Analytlösungen/Probenverluste eliminieren und (3) in bestehende Massenspektrometertechnologien zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse integriert werden könnte. Vor diesem Hintergrund haben wir eine kovalente Modifikation entwickelt, die in der Lage ist, die Ionenmobilität tryptischer Peptide in der Bottom-up-Proteomik bei minimaler Auswirkung auf ihre Masse signifikant zu verändern, um eine Anreicherung in der Gasphase (timShift) zu ermöglichen. Wir haben das molekulare Gerüst umfassend optimiert, um ein dikationisches, aerodynamisches, cysteinreaktives Reagenz zu erhalten, das die Ionenbeweglichkeit von markierten Peptiden erhöht, sie von unmodifizierten Peptiden mit ähnlicher m/z physikalisch trennt und ihre gezielte Sequenzierung und Quantifizierung in ganzen Proteomen ermöglicht. Zum Nachweis des Konzepts erstellten wir Profile von mehr als 8,200 reaktiven Cysteinstellen, wiesen eine 20-fache Steigerung der Empfindlichkeit im Vergleich zur Desthiobiotin/Streptavidin-Anreicherung nach, führten aktivitätsbasierte Proteinprofile von kovalenten Fragmenten und selektiven Elektrophilen (z. B. Sulfopin, einem selektiven kovalenten PIN1-Inhibitor) in einem 96-Well-Plattenformat durch und erstellten erfolgreich Profile der Cysteinreaktivität mit nur 20,000 Zellen/Probe. Diese neuartige Technologie erwies sich als vielversprechender „Drop-in“-Ersatz für die DTB/Streptavidin- Affinitätsanreicherung, und das Geri-Labor wendet diesen Arbeitsablauf derzeit bei der Entdeckung kurzer Peptidinteraktionen mithilfe von μMap sowie bei zahlreichen anderen Kooperationsprojekten bei Weill Cornell Medicine an.
