Strukturierung von Lipidmembranen: Untersuchungen zur Lipid-Protein-Wechselwirkung und Kontaktmechanik auf der Ebene kleinster Molekülverbände
Final Report Abstract
Mit Hilfe mikrostrukturierter Lipiddoppelschichten konnte das Bindungsverhalten von Annexin A1 und Annexin A2t an festkörperunterstützte Lipidmembranen aus POPC und POPS untersucht werden. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass bei beiden Proteinen eine irreversible Bindung nur in Anwesenheit von POPS auftritt. Durch begleitende rasterkraftmikroskopische Aufnahmen konnte die laterale Organisation der Annexine auf der Lipidmembran aufgeklärt werden. Es zeigte sich, dass sich die Proteine in Form lateraler Aggregate (zweidimensionale Domänen) auf der Oberfläche anordnen und der der Belegungsgrad und die Größe der Domänen sowohl von der Membranzusarnmensetzung als auch der Calciumkonzentration abhängig sind. Mit zunehmendem POPS-Gehalt und Calciumkonzentration steigt der Belegungsgrad an und der mittlere Domänenradius wird kleiner. Ferner wurde das thermotrope Phasenverhalten von festkörperunterstützten Phospholipidbilayern untersucht. Dazu wurden mikrostrukturierte, frei stehende Membranstreifen präpariert und mit Hilfe der bildgebenden Ellipsometrie untersucht. Dadurch konnten die temperaturabhängigen Verläufe der Schichtdicke und der lateralen Membranausdehnung parallel beobachtet werden. Die ermittelten Phasenübergangstemperaturen von DMPC, diCisPC und DPPC lagen 2 - 3 °C oberhalb der Literaturwerte für liposomale Systeme. Überraschend war die deutliche Verringerung der Kooperativität der Phasenumwandlung, was auf einen großen Einfluss des Substrats bei den festkörperunterstützten Lipidmembranen schließen lässt. Es zeigte sich, dass es unbedingt nötig ist einen internen Standard einzuführen. Bei der Analyse des thermotropen Phasenübergangsverhaltens von DMPC/Cholesterol - Gemischen wurde daher die individuelle Adressierbarkeit der strukturierten Lipidmembranen ausgenutzt und ein Lipidstreifen aus reinem DMPC als Standard verwendet. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass das für Phospholipide typische Phasenübergangsverhalten ab 30 mol% Cholesterol in der Membran nicht mehr vorhanden ist. Dies ist auf die Bildung einer nur durch höhere Sterole induzierten fluiden Phase mit hoch geordneten Acylketten zurückzuführen. Gegen Ende der Projektlaufzeit gelang es, durch die Zugabe von Ethanol zu einer mikrostrukturierten DMPC-Membran die Bildung eines interdigitierten Bilayers zu induzieren. Dieses Phänomen wurde dann auch als Funktion des Cholesteringehaltes untersucht. Die selektive Immobiliesierung von funktionalisierten Liposomen gelang über die in situ Synthese von Lipopetiden, die als Rezeptor fungieren. Typischerweise wurden Oligopeptide wie z.B. His6Cys oder Lys6Cys verwendet Damit können auf bestimmten Lipidstreifen Liposomen mit Ni-NTA oder POPS-Lipiden immobilisiert werden. Insgesamt wurden nahezu alle Teilziele verwirklich. Lediglich das Nanoabruck-Verfahren zur Herstellung mikrostrukturierte Membranen wurde eingestellt, da Arbeiten von Lenhert et al. Small 2007 gezeigt haben, dass sich für kleinste Lipidstrukturen die Dip-pen Technologie besser eignet. Die Arbeiten zur Biolothografie werden zur Zeit noch weitergeführt, wobei Strategien der Funktionalisierung von Rastersonden auf Basis von Thiol-tragenden Succinimidderivaten in einem etwas anderem Zusammenhang publiziert wurden (Janke et al., Biochemistry 2008). Als Fazit läßt sich festhalten, dass individuell strukturierte Lipidmembransegmente eine Vielzahl physikalischer und biochemischer Fragestellungen zulassen und die Güte von Daten, wie die Adsorption von Proteinen und das Phasenphasenverhalten von Lipidmembranen, stark verbessern wenn nicht gar erst signifikant machen.
Publications
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