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Energy transfer and enforced intercalation: Responsive as well as bright DNA-based high performance probes for RNA imaging in live cells

Subject Area Biological and Biomimetic Chemistry
Term from 2007 to 2018
Project identifier Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 52097295
 
Final Report Year 2018

Final Report Abstract

Fluorogene Hybridisierungssonden erlauben es, RNA-Moleküle und RNA-Transport in lebenden Wildtypzellen in Echtzeit zu visualisieren. Leistungsfähige Sonden erfahren bei Bindung an die Ziel-RNA eine deutliche Intensivierung der Fluoreszenzemission. Eine zentrale Rolle bei der bildgebenden Analyse spielt jedoch auch die Helligkeit der Sonden, durch die das Signal-Rausch-Verhältnis bestimmt wird. Wir begegneten der Herausforderung, Responsivität und Helligkeit einer Hybridisierungssonde gleichzeitig zu steigern. Für eine gleichzeitige Visualisierung verschiedener RNA-Targets erweiterten wir die Palette verfügbarer Farben. Wir etablierten ein RNA-tag, das die Visualisierung von mRMA in lebenden Zellen erleichtert. Das Forschungsvorhaben basierte auf den von uns etablierten FIT-Sonden, bei denen Cyaninfarbstoffe der Thiazolorange(TO)-Familie als fluorogenes Surrogat einer Nukleobase erzwungen interkaliert werden. Um die Helligkeit der TO-Emission zu steigern, führten wir Locked Nucleic Acid (LNA)-Bausteine in die FIT- Sonden ein. LNA verfestigt das Rückgrat in der Umgebung des Farbstoffs und in der Tat demonstrierten wir, dass LNA die TO-Emissionsquantenausbeute erhöht. Dies setzt voraus, dass der LNA-Baustein in unmittelbarer Nachbarschaft des TO-Farbstoffs positioniert wird. Wir zeigten, dass der helligkeitserhöhende „LNA- Effekt“ auch auf andere Vertreter der TO-Familie wirkt, so dass mit LNA-verstärkten BO-, TO- und den in diesem Vorhaben entwickelten QB-FIT-Sonden blau, grün und rot emittierende Sonden zur Verfügung stehen. Wir demonstrierten den gleichzeitigen Nachweis zwei verschiedener, intrazellulärer RNA-Moleküle. Die vorteilhaften Eigenschaften der LNA-verstärkten FIT-Sonden nutzten wir in Zusammenarbeit mit Anne Ephrussi, um den Transport von Ribonucleoproteinpartikeln in Oocyten von Drosophila melanogaster zu verfolgen. Einen alternativen Ansatz zur Verbesserung des Ansprechverhaltens und Steigerung der Helligkeit bietet der gleichzeitigen Einbau von TO und dem Oxazolopyridin-Abkömmling JO. Obwohl TO/JO-FIT-Sonden im Einzelstrang sehr dunkel sind, führt die Zugabe des RNA-Targets zu einem Duplex, der sehr hell emittiert (heller als Fluorescein). Die geringe Fluoreszenz einzelsträngiger Sonden liegt an der Möglichkeit der Bildung von H-Aggregat-ähnlichen TO-JO-Komplexen. Im Doppelstrang hingegen ist der TO-JO-Kontakt nicht mehr möglich. Nun wirkt TO als Lichtsammler, in dem Anregungsenergie von TO auf den sehr hellen, lediglich um 10 bathochrom verschobenen JO-Farbstoff transferiert wird. Die hohe Helligkeit und das ausgezeichnete Ansprechverhalten gestatteten es, oskar-mRNA in fixierten Oocyten von Drosophila melanogaster in einer waschfreiem Färbemethode binnen 1.5 h zu lokalisieren. Die Kombination aus dem fluoreszenten Basensurrogat und einem in > 12 nt Abstand angebrachtem Cy7-Farbstoff liefert qFIT-Sonden, die neben einem hybridisierungssensitiven Kanal einen zweiten Detektionskanal bieten, der Hinweise auf die intrazelluläre Konzentration der Sonde gibt. Durch Ratio-Messungen kann die Konzentration gebundener mRNA an einem beliebigen Bildpunkt bestimmt werden. Diese Methode zeigte, dass die Konzentration von oskar-mRNA in einer 0.075 µm3 großen Volumeneinheit am posterioren Pol der Oocyten von Drosophila m. Spitzenwerte von 1.8 µM betragen kann, was einer 400-fachen Anreicherung entspricht. Die qFIT-Sonden werden in laufenden Arbeiten eingesetzt, um zu unterscheiden, ob ein TO-Signal von einer geringen Konzentration gebundener Sonde oder von einer lokal hohen Konzentration ungebundener Sonden stammt. Wir entwickelten eine Erkennungssequenz, die in 45 Wiederholungen zur Modifizierung/Markierung intrazellulärer mRNA genutzt wurde. FIT-Sonden im blauen, grünen und roten Bereich der Emission wurden so entworfen, dass die Selbstlöschung bei benachbarter Hybridisierung minimiert wird. Wir zeigten, dass die Kombination verschiedener FIT-Sonden bei geeigneter Positionierung der fluoreszenten Basensurrogate FRET ermöglicht, was genutzt werden könnte, um die Anzahl der Detektionskanäle zu erhöhen. Wir konstruierten in Zusammenarbeit mit Prof. Löwer HEK-Zellen, die getaggte mRNA für das mCherry-Protein stabil und induzierbar exprimieren. Diese Zelllinie wurde genutzt, um Bedingungen für die Lebendzellbildgebung an HEK-Zellen zu optimieren. Eine vergleichende Studie zeigte, dass FIT-Sonden durch Behandlung mit Streptolysin-O in lebende HEK-Zellen eingeschleust und zur bildgebenden Analyse der mRNA-Lokalisierung verwendet werden können. Für Untersuchungen der Influenza-Infektion lebender A549-Zellen ist die Einschleusung durch hochverzweigtes Poylgycerolamin vorteilhaft. In lebende Oocyten von Drosophila m. wurden metabolisch stabilisierte FIT-Sonden durch Mikroinjektion eingeführt. Erstmals konnte in genetisch unmodifizierten, d.h. Widtyp-Oocyten von Drosophila m. die Beweglichkeit von oskar-Ribonucleoproteinpartikeln ermittelt werden.

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