Molekulare Analyse des Kinetochor von Saccharomyces cerevisiae
Final Report Abstract
Kinetochore sind komplexe chromosomale Strukturen, die bei der Chromosomensegregation mehrere Aufgaben haben. Ihre prinzipielle Funktion ist die Anheftung der Schwesterchromatide an den Spindelapparat. Dabei ist das Einfangen nicht angehafteter Kinetochore durch Mikrotubuli ein kritischer Schritt. Kinetochore regulieren außerdem den Verlauf der Mitose. Sie initiieren den spindel assembly checkpoint (SAC) und verhindern damit den Beginn der Anaphase bis alle Kinetochore einer Zelle bipolar angeheftet sind. Das S. cerevisiae Kinetochor baut sich aus drei Einheiten auf. Centromer-Chromatin, eine Mikrotubuli bindende Struktureinheit und einen zentralen verbindenden Teil mit (unter anderem) dem COMA und MIND Komplex. Wir haben im Berichtszeitraum drei Teilprojekte bearbeitet: 1) Aufbau des zentralen Teils des S.cerevisiae Kinetochors: In vitro Rekonstitution sowie die Anreicherung der Proteine des zentralen Netzwerks aus Wildtyp und mutierten Zellen und die nachfolgende vergleichende Quantifizierung (Massenspektrometrie) der einzelnen Proteine erbrachten folgende Ergebnisse: Drei Komponenten (Okp1, Ctf19, Mcm21) des COMA Komplexes bilden einen trimeren Komplex, der für die beobachteten Wechselwirkungen mit den anderen Komponenten des zentralen Netzwerks verantwortlich ist. Ame1, die vierte COMA Untereinheit, ist dafür nicht notwendig. Ein Teil der Wechselwirkungen (mit Nkp1, Nkp2) hängt direkt von Okp1, ein zweiter Teil (mit Ctf3, Mcm16, Mcm22, Chl4, Iml3) direkt von Ctf19/Mcm21 ab. Die optimale Interaktion mit dem MIND Komplex und Cse4 (einer Komponente des Centromer-Chromatins) benötigt sowohl Okp1 wie auch Ctf19/Mcm21. 2) Mps1 abhängige Phosphorylierung von Ndc80: Mps1 ist eine für den SAC essentielle Proteinkinase. Ndc80 ist eine Untereinheit des Mikrotubuli bindenden Ndc80 Komplexes. Es wurde gezeigt, dass Mps1 Ndc80 in vitro phosphoryliert und dass die Überexpression von Mps1 in vivo zu einem hyperphosphorylierten Ndc80 führt. Vortäuschen einer Phosphorylierung an 14D vierzehn identifizierten Ndc80 Phosphorylierungsstellen (ndc80 ) resultierte in einem konstitutiv aktivierten SAC (und Zelltod), obwohl alle getesteten Kinetochorparameter (insbesondere die 14D bipolare Spindelanheftung) nicht beeinträchtigt waren. Außerdem ließ sich die ndc80 Mutante durch Ausschalten des SAC retten. Die untersuchte Phosphorylierung ist daher möglicherweise ein integraler Schritt der SAC Aktivierung. 3) Stu1 Oligomerisierung an nicht angehefteten Kinetochoren: Stu1 ist ortholog zu CLASPs höherer Eukaryoten. Stu1 und CLASPs binden an interpolare Mikrotubuli und stabilisieren die Spindel. Außerdem lokalisieren sie temporär an Kinetochoren. Wir konnten zeigen, dass Stu1 spezifisch an Kinetochoren lokalisiert, die nicht an Mikrotubuli angeheftet sind und es dort das Einfangen dieser Kinetochore ermöglicht. Die Bindung an freie Kinetochore führt offensichtlich zu einer Oligomerisierung von Stu1 und dies zu einer Konkurrenzsituation, die eine Bindung von Stu1 an die Spindel verhindert. Die Oligomerisierung von Stu1 an freien Kinetochoren reguliert daher das Einfangen der Kinetochore und den Spindelaufbau in umgekehrter Weise.
Publications
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