Stickstoffregulation in Bakterien: PII-homologe Proteine als zentrale Signalwandler und vielseitige Signalüberträger
Zusammenfassung der Projektergebnisse
In diesem Projekt wurden wesentliche Grundlagen der Signaltransduktion durch das Protein PII in Cyanobakterien (mit den Modellorganismen Synechococcus elongatus und Synechocystis PCC 6803) aufgeklärt sowie neue Erkenntnisse zum PII-homologen Protein GlnK aus Bacillus subtilis gewonnen. Im ersten Teil des Projektes wurden neue Einblicke in den Signalinput durch PII-Proteine gewonnen. Bei einzelligen Cyanobakterien wird das PII Protein abhängig von der Stickstoffund Kohlenstoffversorgung der Zellen an einem Serin-Rest 49 phosphoryliert, welcher an der Spitze eines großen flexiblen Loops sitzt, dem T-loop, der für die Interaktion von PII mit seinen Rezeptoren entscheidend ist (s.u.). Die PII Phosphatasen der Cyanobakterien Synechocystis PCC 6803 und Thermosynechococcus, die zur Klasse der PP2C Phosphatasen gehören, wurden biochemisch und strukturell gründlich charakterisiert. In der Kristallstruktur ist im Unterschied zur eukaryontischen PP2C ein drittes Metall (Mg2+ oder Mn2+) im katalytischen Zentrum nachgewiesen worden sowie eine flexible Subdomäne identifiziert worden, dessen Konformation sich im Verlauf der Katalyse ändert. Die S49- Phosphorylierung dient in vivo dem regulatorischen „Feintunig“, der Optimierung der Nitratassimilation in Antwort auf unterschiedliche Lichtverhältnisse (Redox-Steuerung) und der Steuerung der Argininbiosynthese (s.u.). Im zweiten Teil des Projektes wurden die Wechselwirkungen von PII mit seinen Rezeptoren N-Acetylglutamat-Kinase (NAGK) und PipX analysiert. NAGK katalysiert die durch Arginin feedback-regulierte Schlüsselreaktion der Argininbiosynthese. NAGK wird offensichtlich in allen oxygen phototrophen Organismen durch PII reguliert, also auch in höheren Pflanzen, wie am Beispiel von Arabidopsis thaliana experimentell belegt werden konnte. Die Interaktion ist dabei so hoch konserviert, dass sich in vitro NAGK und PII vom Cyanobakterium S. elongatus und der höheren Pflanze A. thaliana wechselseitig erkennen. Die Interaktion geht mit einer starken Konformationsänderung des T-loops einher. Der Prozess der Interaktion läuft in zwei Stufen ab, wobei ein Erstkontakt zwischen peripheren Regionen von NAGK und PII die T-loop Konformationsänderung auslöst, welche anschließend die stabile Interaktion von PII mit NAGK ermöglicht. Diese Interaktion wird durch T-loop-Phosphorylierung sowie durch erhöhte 2-Oxoglutarat Spiegel (in Gegenwart von Mg-ATP) inhibiert. Ein weiterer Rezeptor von PII ist das 10 kDa Protein PipX. Dieser Komplex bildet sich nur bei niedrigem Oxoglutarat-Spiegel aus und ist insensitiv gegenüber der PII Phosphorylierung. Wenn PipX nicht durch PII gebunden wird, dann bindet es (in Gegenwart von 2-Oxoglutarat) an den Transkriptionsfaktor NtcA. In Abwesenheit von PipX ist die starke Induktion NtcA- abhängiger Gene unter Stickstoffmangel gestört, PipX also ein Co-Aktivator von NtcA. Somit moduliert PII durch seine PipX-Interaktion die Verfügabarkeit dieses Co-aktivators für NtcA, was ein neues Regulationsprinzip bakterieller Genexpression darstellt. Im letzten Teil des Projektes wurde das PII Protein GlnK aus B. subtilis charakteirsiert. Es wurde einer ternärer Komplex aus GlnK, AmtB und dem Transkriptionsfaktor TnrA nachgewiesen, dessen Stabilität durch die Mg-ATP Konzentration moduliert wird, nicht aber auf 2-Oxoglutarat reagiert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(Siehe online unter https://doi.org/10.1099/mic.0.037309-0)
