Aufbau, Struktur und Funktion von Ubiquitin Ligase Komplexen der humanen CBC Familie und homologer Komplexe der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen dieses Forschungsprojektes wurden zwei modular aufgebaute Enzymkomplexe des Ubiquitin-Proteasom-Systems untersucht, deren Substratspezifität durch variable Adaptoruntereinheiten bestimmt wird. Das Tumorsuppressorprotein pVHL ist die substratbindende Untereinheit des CBCVHL Ubiquitin Ligase Komplexes, während Kofaktoren der UBX-Proteinfamilie die Spezifität der chaperon-ähnlichen AAA ATPase Cdc48 regulieren. Im ersten Teilprojekt ermöglichte die Etablierung biochemischer Methoden zur Bestimmung von thermodynamischer Stabilität, Substratbindung und – ubiquitylierung die quantitative Analyse von mutationsbedingten Funktionsverlusten von pVHL, die im Rahmen der von-Hippel-Lindau´schen Erkrankung bei unterschiedlichen Tumorarten auftreten. Es konnte gezeigt werden, dass das Risiko für Nierenzellkarzinome direkt korreliert mit den Defekten in der Bindung und Ubiquitylierung des zellulären Schlüsselsubtrates, HIF-1/2α. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass Mutationen, die mit der Entstehung von Phäochromozytomen assoziiert sind, die Entfaltung von pVHL und die Destabilisierung des CBCVHL Komplexes verursachen. Im Rahmen der biochemischen Charakterisierung von pVHL wurde der ternäre VCB Teilkomplex von CBCVHL durch NMR-Spektroskopie analysiert. Dieser Ansatz erlaubte den direkten Nachweis von krankheits-assoziierten Konformationsstörungen in pVHL sowie künftige hochauflösende Bindungsstudien. Um neue zelluläre Substrate von CBCVHL zu identifizieren, wurde in Saccharomyces cerevisiae ein ´two-hybrid´-System etabliert, das die physiologische Interaktion von pVHL mit HIF-1/2α rekonstituiert. In einem ´two-hybrid´-Screen mit diesem System wurden mehrere Kandidaten für neue CBCVHL-Substrate identifiziert, darunter Diacylglycerolkinase iota. Im zweiten Teilprojekt konnte nachgewiesen werden, dass die evolutionär weitverbreitete UBX-Domäne ein Bindemodul für Cdc48 ist, und dass alle sieben UBX-Proteine aus Saccharomyces cerevisiae als bona fide Spezifitätsfaktoren an Cdc48 binden. Die zelluläre Funktion eines dieser UBX-Proteine konnte aufgeklärt werden. Ubx2 ist ein integrales Membranprotein des ER und spielt eine zentrale Rolle in der ER-assoziierten Proteindegradation, indem es Cdc48 an die ER-Membran rekruiert. Neben der UBX-Domäne konnte die PUB-Domäne, die in allen Eukaryoten außer Hefen vorkommt, als weiteres, neues Bindemodul für Cdc48 identifiziert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2005). Membrane-bound Ubx2 recruits Cdc48 to ubiquitin ligases and their substrates to ensure efficient ER-associated degradation. Nat. Cell Biol. 7, 999-1006
Schuberth, C., und Buchberger, A.
- (2006). Cdc48 (p97) and its cofactors. In: Protein Degradation, Vol. 3: Cell Biology of the Ubiquitin-Proteasome System. R.J. Mayer, A.J. Ciechanover, M. Rechsteiner (eds.), Wiley-VCH, Weinheim, pp. 194-211
Buchberger, A.
- (2006). Renal cell carcinoma risk in type 2 von Hippel-Lindau disease correlates with defects in pVHL stability and HIF-1alpha interactions. Oncogene 25, 370-377
Knauth, K., Bex, C., Jemth, P., und Buchberger, A.
- (2006). The PUB domain functions as a p97 binding module in human peptide N-glycanase. J. Biol. Chem. 281, 25502-25508
Allen, M., Buchberger, A., und Bycroft, M.
- (2007). A yeast two-hybrid system reconstituting substrate recognition of the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. Nucleic Acids Res., 35, e142
Bex, C., Knauth, K., Dambacher, S., und Buchberger, A.
