Membranpotentialsteuerung von Ca-Freisetzung und Ca-Einstrom im Skelettmuskel und ihre Modulation durch diffusible Liganden
Final Report Abstract
Die Membranpotential-gesteuerte Ca-Freisetzung im Verlauf der elektromechanischen Kopplung (EMK) des Skelettmuskels beruht auf der Interaktion zweier Ca-Kanäle, des Dihydropyridin(DHP)-Rezeptors im transversalen Tubulussystem (T-System) und des Ryanodinrezeptors (RyRl) im sarkoplasmatischen Reticulum (SR). Der DHP-Rezeptor vermittelt neben der Steuerung der Ca-Freisetzung auch einen langsam aktivierten Ca-Einstrom aus dem Extrazellulärraum. Die komplizierte Interaktion von zwei Membranen bei der Potentialsteuerung der Ca-Freisetzung stellt besondere Anforderungen an das experimentelle Vorgehen. Ein wesentlicher Teil unserer Arbeit zielte darauf ab, den Ca-Flux aus dem SR in isolierten Säugermuskelzellen bei Depolarisation des T-Systems unter Voltage-Clamp-Bedingungen zu untersuchen. Mit von uns optimierten Techniken untersuchten wir funktionelle Veränderungen im molekularen Steuerungsapparat der elektromechanischen Kopplung durch natürliche Mutationen, durch die gezielte Protein-Ausschaltung und durch die Transfektion von Genmaterial zur Neuexpression von veränderten Proteinen. Als Präparate dienten einerseits Myotuben, die es ermöglichen, fremde Proteine in einer muskelspezifischen Umgebung zur Expression zu bringen, andererseits enzymatisch isolierte ausdifferenzierte Muskelfasern von genetisch veränderten Mäusen. In Myotuben einer Muskel-Zelllinie mit defektem Gen für die αIS-Untereinheit des DHP- Rezeptors verglichen wir nach heterologer Expression verschiedener spannungsabhängiger Ca-Kanäle den Ca-Einstrom und den fluorimetrisch bestimmten Ca-Zustrom (verursacht durch die Summe von Ca-Einstrom und Ca-Freisetzung) und demonstrierten Charakteristika, die auf Unterschieden in der Protein-Zielfindung und in der Interaktion mit den endogenen RyR1-Kanälen zurückzuführen sind. Weiterhin überexprimierten wir ein neu entdecktes DHP-Rezeptor-Bindungsprotein (JP45) in C2C12-Myotuben und fanden eine Erhöhung der Ca-Freisetzungsrate, die eine modulierende Wirkung auf die elektromechanische Kopplung nahelegte. Zusätzlich widmeten wir uns dem Studium von RyR1-Mutationen, die beim Menschen zu Maligner Hyperthermie (MH) und Central Core Disease (CCD) führen, sowohl in Myotuben, als auch in immortalisierten B-Zellen und neuerdings in Muskelfasern einer transgenen Maus. Einen weiteren Schwerpunkt der Arbeit bildete die Charakterisierung der Muskulatur einer Maus mit ausgeschaltetem Gen für die γ-Untereinheit des DHP-Rezeptors. Diese akzessorische Untereinheit des T-tubulären Ca-Kanals moduliert nach unseren Untersuchungen über die Spannungsabhängigkeit der DHP-Rezeptor-Inaktivierung die Ca-Freisetzung aus dem SR und besitzt Eigenschaften eines endogenen Ca-Antagonisten.
Publications
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