Untersuchungen zum Katalysemechanismus der phosphatabhängigen Pyruvatoxidase aus L.plantarum (POX)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die oxidative Decarboxyllerung von Pymvat durch die Thiamindiphosphat-abhängige POX aus Lactobacillus plantarum, für die neben Sauerstoff Phosphat als Substrat benötigt wird und die zur Bildung von Acetylphosphat führt, verläuft über die Reaktionsintermediate Lactylthiamindiphosphat, Hydroxyethylthiamindiphosphatenamin, Hydroxyethylthiamindiphosphatradikal und ein anionisches Phosphatradikal Addukt, welches durch die Kopplung von Phosphorolyse und einem Zweischrittelektronentransfer vom Hydroxyethylthiamindiphosphatenamin zum FAD entsteht. Die Decarboxylierung des Reaktionsintermediates Lactylthiamindiphosphat, dass nach Addition von Pymvat an das C2 des Thiamindiphosphats gebildet wird, ist stereoelektronisch kontrolliert und limitiert die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion. Durch die Generierung von Enzymvarianten konnten die mit den genannten Intermediaten in Wechselwirkung tretenden Aminosäureseitenketten der POX identifiziert werden. Schliesslich konnten mit Hilfe der für Thiamindiphosphat abhängigen Enzyme etablierten Methode der Bestimmung der Intermediatsverteilung im steady-state der Katalyse die Geschwindigkeitskonstanten aller Reaktionsschritte im Katalysemechanismus kalkuliert werden. Die abschliessend durchgeführten Kristallstrukturuntersuchungen zur dreidimensionalen Struktur der im aktiven Zentrum gebundenen Reaktionsintermediate zeigt die vorhergesagte stereoelektronische Kontrolle der Decarboxylierung von Lactyl-thiamindiphosphat durch eine senkrechte Ausrichtung der Ca-C02'-Bindung zur Thiazoliumringebene sowie einen nicht ganz planaren aromatischen Thiazoliumring („Überraschung") und das Vorliegen des Reaktionsintermediates Hydroxyethyl-thiamindiphosphat in der resonanzstabilisierten Enaminfomi mit einem im aktiven Zentrum gleichzeitig gebundenen Phosphat. Damit wird die aus den kinetischen Messungen abgeleitete Kopplung von Elektronentransfer und Phosphorolyse gestützt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Radical Phosphate Transfer Mechanism for the Thiamin Diphosphate- and FAD-Dependent
Pyruvate Oxidase from Latobacillus plantarum. Kinetic Coupling of Intercofactor Electron
Transfer with Phosphate Transfer to Acetyl-thiamin Diphosphate via a Transient FAD
Semiquinone/Hydroxyethyl-ThDP Radical Pair
Biochemistry 44, 13291-13303 (2005)
K. Tittmann, G. Wille, R. Golbik, A. Wedner, S. Ghisla, G. Hübner
- The Role of Val-265 for Flavin Adenine Dinucleotide (FAD) Binding in Pyruvate Oxidase:
FTIR, Kinetic, and Crystallographic on the Enzyme Variant, V265A
Biochemistry 44, 5086-5094 (2005)
G. Wille, M. Ritter, M.S. Weiss, St. König, W. Mäntele, G. Hübner
- The catalytic cycle of thiamin diphosphate enzyme exomined by cryocrytallography
Nature chem. Biol. 2, (2006) 324-328
G. Wille, D. Meyer, A. Steinmetz, E. Hinze, R. Golbik, K. Tittmann
