Mechanistische und funktionale Charakterisierung des CCR4-NOT-vermittelten mRNA-Abbaus

• Antragsteller: Dr. Filip Pekovic
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Biochemie ; Strukturbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 531520533

Nahezu alle humanen mRNAs tragen an ihrem 3’-Ende einen Polyadenosinschwanz. Der Poly(A)-Schwanz ist von kritischer Bedeutung für die Stabilität und Translatierbarkeit der mRNA. Ein essentieller und hochkonservierter eukaryotischer trans-agierender Effektor ist der CCR4-NOT-Komplex, welcher den Poly(A)-Schwanz eines Großteils der humanen mRNAs enzymatisch verkürzt. Der CCR4-NOT-Komplex wird durch RNA-bindende Proteine (RBPs) zu spezifischen mRNAs rekrutiert. Dieser Mechanismus, bekannt als gezielte Deadenylierung, dient der Zelle zur rapiden genspezifischen Inaktivierung der Expression als Antwort auf interne und extrazelluläre Signale. Defekte in der RBP-vermittelten gezielten Deadenylierung führen häufig zu Krankheiten wie Krebs, Inflammationen und Entwicklungsstörungen. In meinem Forschungsvorhaben werde ich die RBP-vermittelte gezielte Deadenylierung anhand des RBPs Tristetraprolin (TTP) untersuchen. TTP bindet AU-reiche Elemente in der 3‘ untranslatierten Region von zahlreichen mRNAs, deren enkodierte Faktoren in der Immunantwort und Entzündungsreaktion involviert sind. Das Vorhaben werde ich interdisziplinär und mit einer Vielzahl an Kollaborationen durchführen. Zuerst werde ich strukturelle Untersuchungen mittels hochauflösender Einzelpartikel-Kryoelektronenmikroskopie durchführen, um die Struktur vom humanen CCR4-NOT einzeln oder im Komplex mit Substrat-RNA und TTP zu bestimmen. Die identifizierten Interaktionsoberflächen und für die Stabilität kritischen Aminosäuren werden durch biophysikalische Methoden zur Bestimmung der Bindungsaffinitäten und Dissoziationsraten charakterisiert. Funktionsverlustmutanten werden in etablierten in vitro RNA-Degradationsassays und mit Reporter-mRNAs in Zellen untersucht. Nachfolgend beabsichtige ich aufzuklären, ob die molekularen Prinzipien der TTP-vermittelten gezielten Deadenylierung auf andere RBPs anwendbar sind. Dazu werde ich Massenspektrometrie und chemisches Cross-Linking verwenden, um neue RBPs zu identifizieren, die mit CCR4-NOT in humanen Zellen interagieren. Dies wird offenbaren, ob Interaktionspunkte und -mechanismen zwischen RBPs konserviert sind, welche ich zudem mit bekannten Mutationen in Krankheiten korrelieren werde. Außerdem plane ich Cross-Linking und Immunopräzipitation (CLIP) durchzuführen, um direkte Interaktionen zwischen CCR4-NOT und mRNAs zu identifizieren, welches zur Aufklärung des Mechanismus der RBP-unabhängigen gezielten Deadenylierung beitragen wird. Das Forschungsvorhaben soll unser Verständnis des Mechanismus der CCR4-NOT-vermittelten Deadenylierung erweitern, welches von besonderem Interesse für einen Großteil der an Genexpression interessierten Wissenschaftsgemeinde ist. Der molekulare Fokus des Vorhabens hat Potential für translationale Forschung und wird direkt als Plattform für Studien zur Optimierung von mRNA-basierten Therapeutika und Inhibitoren von RBP-vermittelten Interaktionen dienen, um neue Behandlungswege für Krebs und Inflammationen zu identifizieren.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeber: Eugene Valkov, Ph.D.