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Molekulare Determinanten und zelluläre Mechanismen bei der stammspezifischen Ausbreitung des pathologischen Prionproteins PrPSc im Säugerorganismus

Antragsteller Dr. Achim Thomzig
Fachliche Zuordnung Tiermedizin
Förderung Förderung von 2007 bis 2010
Projektkennung Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 53490361
 
Erstellungsjahr 2010

Zusammenfassung der Projektergebnisse

Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) werden nach der Prion-Hypothese von Erregern ausgelöst, die hauptsächlich, wenn nicht ausschließlich, aus einer fehlgefalteten infektiösen Form des Prionproteins (PrPSc) bestehen. TSE-Erreger, oder Prionen, treten in Form distinkter Stämme auf, und steuern jeweils spezifische, zum Teil unterschiedliche Neuronenpopulationen im Hirn an. Die Prionhypothese postuliert, dass die stammspezifische pathogenetische Information von TSE-Erregern in der Faltung bzw. Aggregation oder der Glykosylierung des PrPSc verschlüsselt ist. Vor diesem Hintergrund ist in diesem Projekt zunächst mittels "Protein-Misfolding-Cyclic-Amplification" (PMCA), einem Verfahren zur zellfreien in vitro-Amplifikation von Prionen, die autokatalytische Fehlfaltungsaktivität verschiedener hamsteradaptierter TSE-Stämme untersucht worden. Dabei stellte sich heraus, dass der Scrapie-Stamm 263K "stammspezifisch" repliziert und auch nach dem Verimpfen dieser in vitro generierten Prionen seine Stammcharakteristika beibehält. Ferner deuten erste biochemische Befunde darauf hin, dass dies ebenfalls für die Stämme ME7-H und BSE-H zutrifft. Hier müssen jedoch die Ergebnisse der Untersuchungen aus den Reportertieren abgewartet werden. Die bisher erzielten Befunde gehen daher konform mit der von Stanley Prusiner aufgestellten "Prionhypothese", die postuliert, dass die stammspezifische phänotypische Information von TSE-Erregern in der Faltung und/oder Aggregation des PrPSc liegt und diese in der Lage sind, sich "stammtreu" zu replizieren. Um dies jedoch abschließend beurteilen zu können, müssen einerseits strukturanalytische Daten aus der FT-IR-Spektroskopie und andererseits Untersuchungen zur An- bzw. Abwesenheit weiterer chemischer Komponenten in infektiösen PrPSc-Fraktionen abgewartet werden. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob leichte Änderungen in der Sekundär- und Aggregatstruktur des pathologischen Prionproteins verschiedener hamster-adaptierter TSE- Erregerstämme Einflüsse auf das neuronale "Targeting" von Prionen im Gehirn haben. Hierzu wurden Prionen der Stämme 263K und ME7-H einer schrittweisen Temperaturerhöhung ausgesetzt, an Nitrozellulosepartikel fixiert und intrazerebral in Hamster inokuliert. Hierbei konnten jedoch auch nach eingehenden histologischen und biochemischen Untersuchungen keine Unterschiede im PrPSc-Ablagerungs- bzw. Glykosylierungsmuster der behandelten im Vergleich zu den unbehandelten Prionen des gleichen Stammes festgestellt werden. Obwohl zu diesem Teilprojekt ebenfalls strukturanalytische Daten noch ausstehen, scheint der verwendete Nitrozellulose-Assay keine geeignete Methode zu sein, um diese Fragestellung eingehend zu adressieren. Ferner sollte am Beispiel der neuromuskulären Endplatten verschiedener Säugetierspezies untersucht werden, wie die Erregerausbreitung über synaptische Kontakte bei unterschiedlichen Prionenstämmen erfolgt und in welchen intrazellulären Kompatimenten in den Myozyten PrPSc lokalisiert ist. Hierzu wurden von peroral mit 263K-Scrapie und BSE-H inokulierten Syrischen Hamstern verschiedene Muskeln histologisch eingehend analysiert. Mittels Immunfluoreszenzdoppelmarkierung mit dem lysosomalen Markerprotein Cathepsin D konnte gezeigt werden, dass PrPSc einerseits intramyozytär in Lysosomen anzutreffen ist, sich andererseits aber auch stark subsarkolemmal in der Nähe der inneren T-Tubuli ablagert. Durch nachfolgende ultrastrukturelle Untersuchungen sollen diese Beobachtungen nun verifiziert und hinsichtlich der PrPSc-Färbungen an den synaptischen Kontakten näher analysiert werden. Da, wie sich zeigte, Hamster peroral mit dem Stamm BSE-H nicht erfolgreich infizierbar waren, konnten an diesem Modell keine Immunfärbungen hinsichtlich der Verteilung des pathologischen Prionproteins vorgenommen werden. Außerdem wurden in einer Zeitreihe Muskeln von Mäusen untersucht, die peroral mit dem BSE-Isolat 6PB1 infiziert wurden. Hier zeigte sich, dass in der präklinischen Phase der Erkrankung, PrPSc nur in den muskelassoziierten lymphatischen Geweben akkumuliert. Im späten klinischen Stadium jedoch, konnte pathologisches Prionprotein aber auch eindeutig intrazellulär in den einzelnen Myozyten detektiert werden. Genauere elektronenmikroskopische Untersuchungen müssen nun zeigen, in welchen subzellulären Kompartimenten der Muskelzellen PrPSc lokalisiert ist und ob in diesem Tiermodell ebenfalls eine Ausbreitung der Prionen über periphere Nerven ins Muskelgewebe, analog dem von uns gezeigten Propagationsmechanismus für 263K Prionen in Syrischen Hamstern, stattfindet.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

  • (2007): Detection of pathological prion protein PrPSc in the skin of animals with experimental or natural scrapie, and in prion contaminated soil. Internat. Prion Congress 2007, Edinburgh
    Beekes M, Schulz-Schaeffer W, Wrede A, Wemheueer W, Brenig B, Kratzel C, Lemmer K, Buschmann A, Groschup M, Terytze K, Peters R, Seidel B, Thomzig A
  • (2007): Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years. PLoS One, 5: e435
    Seidel B, Thomzig A, Buschmann A, Groschup M, Peters R, Beekes M, Terytze K
  • (2007): Subcellular localization of PrPSc in muscle fibres. Internat. Prion Congress 2007, Edinburgh
    Wrede A, Beekes M, Thomzig A, Schulz-Schaeffer W
  • (2009). Faecal shedding, alimentary clearance and intestinal spread of prions in hamsters fed with scrapie. Vet. Res., 40: 04
    Krüger D, Thomzig A, Lenz G, Kampf K, McBride P, Beekes M
  • (2009). PrPTSE in muscle-associated lymphatic tissue during the preclinical stage of mice infected orally with bovine spongiform encephalopathy. J. Gen. Virol., 90: 2563-8
    Cardone F, Thomzig A, Schulz-Schaeffer W, Valanzano A, Sbriccoli M, Abdel-Haq, H, Graziano S, Pritzkow S, Puopolo M, Brown P, Beekes M, Pocchiari M
 
 

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