Kinetic and thermodynamic aspects in cooperativity and allostery of oxygen binding of hemocyanins
Final Report Abstract
Das Ziel des beantragten Projektes war es, die Konsequenzen kooperativer Interaktionen für die Regulation von Proteinen im Gleichgewicht und bezüglich des kinetischen Verhaltens besser zu verstehen. Um kooperatives Bindungsverhalten zu erzeugen, sind mindestens zwei verschiedene Konformationen notwendig. Welchen Vorteil bietet das Auftreten weiterer Konformationen, wie es im Falle sauerstofftransportierender Proteine häufig zu linden ist? Wir konnten zeigen, dass unter Gleichgewichtsbedingungen eine hierarchische Erweiterung des MWC-Modells zu grundsätzlich neuen Eigenschaften führt. Im Falle von Arthropden-Hämocyaninen scheint diese funktionelle Hierarchie an die Existenz einer bestimmten Art von 2x6-Struktur gekoppelt zu sein. Eine detaillierte Analyse des Effektors Urat zeigte außerdem, dass Hämocyanin auch nicht-allosterische Bindungsstellen hierfür aufweisen kann. Dies könnte einen bisher unbekarmten „Puffermechanismus" für Effektoren darstellen. In allen Fällen zeigten die Hämocyanine, die unter Gleichgewichtsbedingungen Kooperativität auftviesen, auch kooperatives Verhalten in der Liganden-Dissoziationskinetik, d.h. die mittlere Dissoziationsrate (Kapp) stieg im Verlauf der Reaktion. Unerwarteterweise wies der Verlauf von Kapp mit dem Reaktionsfortschritt im Vergleich der verschiedenen Spezies untereinander eine unerwartet starke Ähnlichkeit auf, obwohl auf Gleichgewichtsebene unterschiedhche kooperative Modelle als funktionelle Grundlage identifiziert worden waren. Der Verlauf war in fast allen Fällen praktisch linear, so dass eine Analyse basierend auf einer nicht-linearen Regression selbst für das einfachste Modell nicht möglich ist, da zu viele freie Parameter vorliegen. Experimente mit Restsauerstoff zeigten wie erwartet eine Form mit mehr Informationsgehalt, waren aber sehr schlecht reproduzierbar. Die wenigen erfolgreichen Versuche bei einem Hämocyanin, das unter Gleichgewichtsbedingungen dem Nested-MWC gehorcht, lassen sich tatsächlich bisher nicht im Rahmen des MWC-Modell auswerten, was auf eine kinetische Bedeutung hierarchischer Funktion hinweisen könnte. Dies muss aber noch durch entsprechende Simulationen untermauert werden. Die Charakteristika des quasi-linearen Verlaufs von Kapp für verschiedene Spezies zeigte keine offensichthche Korrelation mit der Größe der allosterischen Einheit oder der Affinität. Am ehesten war eine Korrelation mit der Zugehörigkeit zur Unterstamm (Chelicerata oder Crustacea) zu beobachten, wobei insgesamt Hämocyanin aus Crustacea eine höhere off-Rate aufwiesen. Simulationen zeigen, dass solch ein linearer Verlauf zumindest im Rahmen des MWC-Modell typisch für nicht zu schnelle Konformationsübergänge und nicht zu große allosterische Gleichgewichtskonstanten ist. Sie zeigen auch, dass unter den gegebenen experimentellen Bedingungen die maximale Steigerung der apparenten Dissoziationsrate auf einen Faktor limitiert ist, der in etwa der Größe der allosterischen Einheit entspricht und dies nur bei genügen schnellen Konformationsänderungen erreicht wird. Unerwartet und im Gegensatz zu gängigen ad-hoc Interpretation war unser Befund, dass die apparente Off-Rate allenfalls in den letzten < 1% des Reaktionsverlaufs direkt zum Tragen kommt, und daher experimentell nicht erfassbar ist. All diese Ergebnisse sind prinzipiell im Einklang mit unseren experimentellen Daten. Um zumindest Grenzen für die Werte der einzelnen kinetischen Parameter für die verschiedenen Hämocyanine angeben zu können, müssen allerdings noch weitere Simulationen durchgeführt werden, bei denen Parameterkombinationen systematisch variiert werden. Die erhaltenen Kurven werden dann mit den Experimenten verglichen. Da dies selbst für das MWC-Modell eine recht aufwändige Arbeit ist, wollen wir dies zunächst als theoretische Arbeit veröffentlichen, die die grundsätzlichen kinetischen Charakteristika eines MWC-Modells demonstriert. In einem zweiten Schritt wollen wir dann die experimentellen Daten vor diesem Hintergrund interpretieren und veröffentlichen. Eine rein deskriptive Veröffentlichung der Daten erscheint uns nicht sinnvoll.
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