Struktur und Regulation von Pleckstrin in der Signaltransduktion von Blutplättchen
Final Report Abstract
Das Pleckstrin Protein kommt in hohen Konzentrationen in Blutplättchen und Leukozyten vor. Die Phosphorylierung von Pleckstrin durch Protein Kinase C (PKC) stimuliert zelluläre Signaltransduktionswege und ist ein charakteristischer Indikator für die Aktivierung von Blutplättchen. Das vorliegende Projekt liefert strukturelle und biochemische Grundlagen zum Verständnis der molekularen Funktionen des menschlichen Pleckstrin Proteins. Hierbei wurde ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der NMR-Spektroskopie, in Lösung Röntgenstrukturanalyse und Kleinwinkelstreuexperimente kombiniert. Phosphorylierung und die Wechselwirkung mit Phospholipiden wurden in biochemischen Experimenten und mittels NMR untersucht. Wir haben die drei-dimensionale Struktur der DEP and PH2 Domänen von Pleckstrin bestimmt. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die PH2 Domäne Phosphatidylinositol (3,4) bisphosphat (PtdIns(3,4)P2) mit hoher Selektivität bindet, und dass diese Domäne strukturell unabhängig vom PH1-DEP Modul ist. Umfangreiche NMR und biochemische Untersuchungen von Wildtyp und phosphorylierten Doppeldomänkonstrukten zeigen, dass die Phosphorylierung von Pleckstrin eine intramolekulare Wechselwirkung der PH1 und DEP Domänen aufhebt und dadurch die Phospholipid Bindungstasche der PH1 Domäne zugänglich macht. Aufgrund der Resultate dieses Projektes schlagen wir ein Model für die molekularen Funktionen von Pleckstrin vor. Unsere Strukturuntersuchungen haben gezeigt, dass Wildtyp Pleckstrin eine geschlossene Konformation einnimmt, in der die PH1 und DEP Domänen in einer kompakten Anordnung vorliegen. Phoshorylierung des PH1-DEP Linkers führt zu einer offenen Konformation, in der die Phospholipidbindungstasche der PH1 Domäne zugänglich wird. Es erscheint daher möglich, dass die PtdIns(3,4)P2 Bindung der PH2 Domäne, und die bekannte, weniger selektive Interaktion von PH1 mit PtdIns(4,5)P2 zu einer verstärkten und spezifischen Membraninteraktion von Pleckstrin führen. Alternativ könnte es sein, dass die durch Phosphorylierung induzierten Konformationsänderungen die Bindung an (noch nicht bekannte) Proteine in der Pleckstrin Signaltransduktionskette ermöglichen. Die Ergebnisse des vorliegenden Projektes liefern neue und unerwartete Erkenntnisse bezüglich der strukturellen Konsequenzen der Phosphorylierung von Pleckstrin sowie die räumliche Anordnung der Pleckstrin PH1, DEP und PH2 Domänen, die eine wichtige Rolle für dessen molekularen Funktionen haben. Die Strukturuntersuchungen waren ein Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer FRET basierter Sensoren, die es gestatten PKC Aktivität in lebenden Zellen zu untersuchen.
Publications
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