Alterations of the STAT3 (Signal transductor and activator of transcription 3) pathway in multiple myeloma
Final Report Abstract
Aufbauend auf den Ergebnissen der ersten Förderperiode stand im Berichtszeitraum die Analyse der lL-6-Zielgene im Multiplen Myelom im Vordergrund. Da nicht nur der STAT3- sondern auch der MAPK Signaltransduktionsweg durch IL-6 stimuliert werden kann, letzterer eine große Bedeutung für das MM besitzt und eine mögliche Interaktion beider Kaskaden von Bedeutung sein könnte, wurde auch dessen Einfluß auf die STATS-Zielgenexpression untersucht. Aus technischen Gründen wurde an den untersuchten Zelllinien in erster Linie die pharmakologische Inhibitionen mit dem neuen, spezifischen JAK-lnhibitor P6, dem MAPK Inhibitor PD98059 sowie der IL-6 Entzug eingesetzt. Darüber hinaus wurden Kokulturen mit isolierten Knochemarksstromazellen verwendet, um die in vivo Situation besser darstellen zu können und zu untersuchen, ob Signale von KM-Stromazellen einen "rescue" nach gezielter Signalblockade erreichen können. Bisher bekannte STAT3-Zielgene wurden durch eine STAT3 Modulation in der Regel moderat beeinflußt, mit einer inversen Regulation für BCL2 und BCLxL. Dagegen konnten wir für den Transkriptionsfaktor c-fos, der bisher im MM noch nicht im Detail untersucht worden war, eine sehr starke, frühzeitg einsetzende Induktion durch IL-6/STAT-3 nachweisen. Da die Inhibition der STAT3 Phosphorylierung auch zu einer verminderten autokrinen IL-6 Sekretion in U266 Zellen führte, spielt c-fos als Transkriptionsfaktor für IL-6 möglicherweise eine zentrale Rolle in der autokrinen Regulation des Myelomwachstums. Interessanterweise wurde die c-fos Expression durch MARK Inhibition ebenfalls vollständig unterbunden, was auf eine Synergie der beiden Signalwege hindeutet. Die MARK ist hierbei wahrscheinlich über die Serin727 Phosphorylierung des STAT3 direkt an der vollständigen STAT3-Aktivierung beteiligt. Die in Zellkultur gewonnenen Erkenntnisse wurden an primärem Tumormaterial mittels IHC und teilweise mit mRNA Expressionsanalyse überprüft. Dabei bestätigte sich immunhistochemisch eine starke Expression von c-fos in der Mehrheit der untersuchten Primärtumorgewebe. Die c-fos Expression scheint in primären MM an eine Aktivierung der MARK, nicht aber zwingend an eine höhergradige STAT3 Aktivierung gekoppelt zu sein. Aufbauend auf den Daten der ersten Förderperiode zur Expression von Cyclin D1 in MM und der Korrelation mit zytogenetischen Alterationen wurden die Relevanz der CyclinDl mRNA Varianten sowie mögliche zugrunde genetische Alterationen des CCND1 Locus and Cyclin D1-positiven MM untersucht. Vorbereitend dazu wurden die Isoform-spezifischen Assays in einem standardisierten Verfahren an das Paraffinmaterial angepasst, um eine möglichst exakte Vergleichbarkeit der Assays zu erreichen. Bei primären Cyclin D1 positiven MM fand sich, im Gegensatz zu den publizierten Daten beim Mantelzelllymphom, kein Hinweis auf eine Korrelation der kurzen Transkriptform mit der Proliferationsaktivität und keine Deletionen oder Mutationen der 3'-UTR Region. Darüber hinaus wurde die Regulation von Cyclin D1 in der ANBL-6 Zellinie im Detail untersucht. Dabei zeigte sich eine Induktion von Cyclin D1 durch Kokultur mit KMStromazellen, nicht aber durch IL-6/STAT-3. Diese Ergebnisse liefern liefern einen Hinweis dafür, warum es im MM auch ohne Alterationen des CCND1 Lokus zur Expression von Cyclin D1 kommen kann, das normalerweise in lymphatischen Zellen nicht exprimiert wird. Ebenfalls aufbauend auf Ergebnissen der ersten Förderperiode wurde eine große Serie primäre extramedulläre Plasmozytome (EMP) durch Interphase-FISH untersucht. Dabei zeigten sich im Vergleich zum MM zahlreiche Ähnlichkeiten, aber auch bedeutende Unterschiede, wie das völlige Fehlen der im MM häufigen t(11;14) Translokation. Diese Daten sind die ersten zytogenetischen Daten zu dieser seltenen Tumorentität überhaupt und geben Einblicke Pathogenese und die Beziehung der EMP zum MM.
Publications
-
Fend F, Bock O, Kremer M, Specht K, Quintanilla-Martinez L. Ancillary Techniques in Bone Marrow Pathology: Molecular Diagnostics on Bone Marrow Trephine Biopsies. Virchows Arch 2005; 447: 909-919
-
Fend F, Kremer M. Diagnosis and classification of malignant lymphoma in the bone marrow trephine biopsy. Pathobiology, 2007;74:133-43. Mao ZR, Quintanilla-Martinez L, Raffeid M, Richter M, Krugmann J, Burek C, Hartmann E,
-
Koch l, Slotta-Huspenina J, Hollweck R, Anastasov N, Hofler H, Quintanilla-Martinez L, et al.: Real-time quantitative RT-PCR shows variable, assay-dependent sensitivity to formalin fixation: implications for direct comparison of transcript levels in paraffin-embedded tissues. Diagn Mol Pathol 2006,15:149-56
-
Kremer M, Ott G, Nathrath M, Specht K, Stecker K, Alexiou C, Quintanilla-Martinez L, Fend F: Primary extramedullary plasmacytoma and multiple myeloma: phenotypic differences revealed by immunohistochemical analysis, J Pathol 2005, 205:92-101.
-
Quintanilla-Martinez L, Kremer M, Specht K, Calzada-Wack J, Nathrath M, Schaich R, Höfler H, Fend F: Analysis of signal transducer and activator of transcription 3 (STATS) pathway in multiple myeloma: STATS activation and cyclin D1 dysregulation are mutually exclusive events. Am J Pathol 2003; 162: 1449-1461
-
Quintanilla-Martinez L, PittalugaS, Miething C, RudeliusM, Davies-HiHT, AnastasovN, Klier M, Martinez A, Vivero A, Duyster J, Jaffe ES, Fend F, Raffeid M. The Transcription factor CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP)R> is constitutively expressed in ALK-positive anaplastic large cell lymphomas, and is dependent upon NPM-ALK kinase activity. Blood 2006, 108:2029-2036
-
Specht K, Haralambieva E, Bink K, Kremer M, Mandl-Weber S, Koch l, Tomer R, Hofler H, Schuuring E, Kluin PM, Fend F, Quintanilla-Martinez L: Different mechanisms of cyclin D1 overexpression in multiple myeloma revealed by fluorescence in situ hybridization and quantitative analysis of mRNA levels, Blood 2004, 104:1120-1126.
