Untersuchungen zur biologischen Bedeutung multipler HIV-Proviren in einzelnen, infizierten Zellen
Final Report Abstract
1. Es wurde eine SlV-spezifische DNA-FISH mit hoher Sensitivität etabliert. In ungefähr 70 bis 80 % SlV-infizierter Zellen der Zelllinie CEMx174 wurden spezifische provirale SlV-Sequenzen nachgewiesen. Dabei konnten in einer Zelle zwischen einem und sechs Signalen detektiert werden. 2. Mit Hilfe dieser SlV-spezifischen DNA-FISH wurden Milzzellen SlV-infizierter Affen untersucht. Mehrfach-infizierte Zellen ließen sich zu jedem Zeitpunkt des Infektionsverlaufes nachweisen. 3. Die Verteilung der Provirus-Frequenzen über den gesamten Infektionszeitraum war sehr ähnlich. Die Mehrzahl der infizierten Zellen trug eine Provirus-Kopie (zwischen 3,8 und 22 % der Gesamtzellen). Zwei- und dreifach-infizierte Zeilen waren seltener vorhanden. Der Nachweis der SIV-Mehrfachinfektion während der Primärvirämie zeigt, dass Rekombinationsereignisse bereits sehr früh zu erwarten sind. Da gleichzeitig die Mehrfachinfektion über den gesamten Infektionsverlauf nachweisbar war, muss man Rekombinationsprozesse als kontinuierlichen, integralen Bestandteil der Virusvariantenproduktion in vivo betrachten. Dies steht im Einklang mit unseren phylogenetischen Analysen von HlV/SIV-Varianten in vivo. 1. Eine HIV-spezifische RNA-FISH zum Nachweis von HIV-RNA in einzelnen mononukleären Zellen (MNC) der Milz einer HlV-infizierten Person wurde erfolgreich etabliert. Dazu wurde HIV zunächst mittels PHA reaktiviert. Über die gleichzeitige Anwesenheit des HIV-Fusionsinhibitors T20 wurde sichergestellt, dass es zu keiner Virusausbreitung in der Zellkultur kam. Ungefähr 2 bis 3 % der MNC waren HIV-positiv. Ein repräsentatives Versuchsergebnis ist in Abbildung 2 dargestellt. 2. HlV-RNA-FlSH-positive Zellen konnten über die Lasermikrodissektion einzeln isoliert werden. Leider war allerdings die sich anschließende RT-PCR nicht sensitiv genug, um ausreichende Transkriptionsanalysen durchzuführen. So wurde mit dieser Methodik nur in 6% isolierter, HlV-transkriptionsaktiver ACH-2 Zellen ein PCR-Produkt erhalten. Bei Hochrechnung der gesamten Zellverluste während der Isolierungs- und Präparierschritte beginnend vom Patientenmaterial würde man von ~1,7 x 10 7 MNC aus der Milz eines HIV- positiven Patienten nur eine erfolgreiche PCR-AmpIifikation einer infizierten Zelle erwarten. Diese Sensitivität beinhaltet bereits eine initiale Booster- Amplifikation mit dem „MessageBOOSTER TM cDNA Synthesis Kit for qPCR" der Firma Epicenter und die Optimierung des Fixativs. Bei derartig geringer Sensitivität waren daher keine statistisch sinnvollen Daten zu erwarten gewesen und wir haben die Versuche leider abbrechen müssen. Die aus diesen Experimenten gewonnen Kenntnisse werden allerdings in den geplanten Übersichtsartikel zur HIV-spezifischen FISH mit eingehen. Zusammenfassung der wesentlichen Ergebnisse: 1. Die Fitness einer bestimmten Variante hängt stark von der Wirtszellumgebung ab. 2. Der AZT-Resistenz-Weg ist durch positive Epistasis zwischen den Mutationen an Position 41 und 215 des Reversen Transkriptase Gens charakterisiert 3. Die epistatischen Interaktionen sind von den Umgebungsbedingungen abhängig, beispielsweise der Anwesenheit oder Abwesenheit von AZT. 4. Die Fitness-Interaktion zwischen Mutationen kann den sequentiellen Fitness- Verlust einzelner Mutationen abpuffern. Zusammenfassend zeigten unsere Daten, dass Fitness-Interaktionen zwischen HIV-Mutationen einen Fitness-Verlust kompensieren können. Dies ist möglicherweise eine typische Eigenschaft der eingeschlagenen, genetischen Pfade bei der Entwicklung Medikamenten-resistenter Virusvarianten. Details sind in dem eingereichten Manuskript wiedergegeben, dass als Kopie beigefügt ist. Zusammenfassung der wesentlichen Modifikationsmaßnahmen der FISH: 1. Zellkernpräparation mit 0,1 M KCl-Lösung und zusätzliche Waschschritte mit Methanol/Eisessig Fixativbei primärem Probenmaterial 2. Einsatz Biotin-markierter DNA-Sonden zwischen 200 und 800 bp Länge 3. Proteolytische Vorbehandlung mit Pepsin (4mg/ml) für 6 min bei 37 °C 4. Shnngentes Waschen mit 2 x SSC, 50 % Formamid, bei 45 °C 5. Optimierung der Belichtungszeit
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