Lysosomal proteins of sphingolipid- and membrane digestion: structure and function

• Applicant: Professor Dr. Konrad Sandhoff
• Subject Area: Public Health, Healthcare Research, Social and Occupational Medicine
• Term: from 2002 to 2009
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5388760

Bausteine zellulärer Plasmamembranen erreichen nach Endozytose die inneren Membranen der späten Endosomen und Lysosomen, mit denen sie verdaut werden. Sphingolipide dieser intralysosomalen Vesikel werden durch Exohydrolasen schrittweise abgebaut. Die funktionelle Wechselwirkung der wasserlöslichen Hydrolasen mit den membranständigen Lipidsubstraten wird an den Phasengrenzflächen durch membranaktive Sphingolipidaktivatorproteine (SAPs, Saposine) und anionische Phospholipide wie Bis(monoacylglycero)phosphat (BMP) ermöglicht. Erbliche Defekte einzelner Exohydrolasen und Aktivatorproteine führen zu lysosomalen, meist fatalen Speicherkrankheiten. Erste biophysikalische und enzymatische Experimente zeigen, daß Aktivatorproteine die Lipidphase von Membranen perturbieren und in einigen Fällen zusätzlich auch Exohydrolasen durch ProteinProtein-Wechselwirkungen aktivieren. Ziel der geplanten Arbeiten ist die Struktur- und Funktionsanalyse einzelner Aktivatorproteine (GM2AP, SAP-A, -B, -C, -D), Exohydrolasen (b-Hexosaminidasen A, B, S und Glucocerebrosidase) und ihrer pathogenen Varianten. Hierfür werden sie in Insekten- und Hefezellen (Pichia pastoris) präparativ exprimiert und rein dargestellt. Die rekombinanten Ptoteine sollen für Röntgenstrukturanalysen kristallisiert und die kleineren Aktivatoren für NMR-Studien mit Isotopen markiert werden. Um die molekularen Abbau-Mechanismen an der Phasengrenzfläche und die Lipid-, bzw. Enzymspezifität einzelner Aktivatorproteine besser zu verstehen, sollen ihre Spezifitäten in liposomalen Enzymtests, ihre Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen mittels Isothermaler Titrationskalorimetrie, Differential Scanning Calorimetry, Filmwaagemessungen, Surface Plasmon Resonanz und Dynamischer Lichtstreuung untersucht werden.

• DFG Programme: Research Grants