Molecular mechanisms of SNARE-patterning
Final Report Abstract
Das SNARE-Motiv ist essentiell für die Bildung von Syntaxin-Clustern Bei der Untersuchung der Mechanismen, die die Syntaxin-Clusterbildung vermitteln, wurde zunächst Syntaxin stark überexprimiert und seine Verteilung in basalen Plasmamembranen mittels hochauflösender Lichtmikroskopie (STED-Mikroskopie) untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass sich die Größe der Cluster nach Syntaxin-Überexpression nicht offensichtlich ändert, die Cluster-Dichte allerdings proportional mit der Syntaxin-Konzentration ansteigt. Auch bei sehr hohen Syntaxin-Konzentrationen bildet sich keine uniforme Syntaxinverteilung, und Syntaxin 1-Cluster bilden sich auch in nicht-neuronalen Zellen. Diese Befunde legen nahe, dass es einen intrinsischen Faktor gibt, der die Größe von Syntaxin-Clustern limitiert, und dass die Bildung von Syntaxin-Clustern keine neuronalen Co-Faktoren benötigt. Des Weiteren wurde ein sogenanntes Co-Cluster Testsystem entwickelt, um die Proteindomäne von Syntaxin zu identifizieren, die den Einbau von Syntaxin in den Cluster vermittelt. Zu diesem Zweck wurden Syntaxin einmal mit einer grünen GFP-Markierung und einmal mit einem myc-tag (das später rot angefärbt wurde) coüberexprimiert. Beide Konstrukte mischen sich zusammen mit dem endogenen Syntaxin in den gleichen Clustern, was sich durch die Überlappung der grünen und roten Markierungen in der mikroskopischen Analyse zeigt. Mit diesem Ansatz wurde getestet, welche Deletion oder Mutation in einem der überexprimierten Konstrukte zu einem Verlust der Kolokalisation (des Co-clusterns, d.h. die Cluster in den unterschiedlichen Kanälen zeigen einen hohen Grad an Überlappung) führt. Wie sich gezeigt hat, war das SNARE-Motiv von Syntaxin für ein effizientes Co-clustern essentiell. Daraus wurde gefolgert, dass, abgesehen von intakten Lipid-Infrastrukturen, homophile Interaktionen des SNARE-Motivs von Syntaxin die Bildung von Syntaxin-Clustern vermitteln. Anatomie und Dynamik von supramolekularen Syntaxin-Clustern Als nächstes wurde untersucht, wie viele Syntaxin-Moleküle sich in einem Cluster aufkonzentrieren und ob Syntaxin-Cluster stabile Strukturen sind oder untereinander Moleküle austauschen. Zunächst wurde durch quantitativen Western-Blot die Anzahl der Syntaxin-Moleküle pro Zelle bestimmt und durch die Anzahl der Cluster in einer Zelle geteilt, woraus sich ein Verhältnis von 90:1 ergab. Zur Untersuchung der Dynamik wurde die FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Methode angewendet. Dabei wurde eine definierte Region der basalen Plasmamembran von intakten, Syntaxin 1A-GFP überexprimierenden Zellen gebleicht und die Wiederkehr der Fluoreszenz in diesem Areal beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz durch Diffusion ungebleichter Moleküle in die Bleichregion regeneriert wird, d.h. Syntaxin-Moleküle sind mobil. Bei diesen Studien konnte weiterhin gezeigt werden, dass das SNARE-Motiv von Syntaxin für eine starke Reduktion der Mobilität verantwortlich ist, wie aus unserem Befund aus dem Co-Cluster Testsystem zu erwarten war, der das SNARE-Motiv als Domäne für den Einbau in Cluster identifiziert hat. Wenngleich Syntaxin mobil ist, so zeigen videomikroskopische Analysen, dass die Cluster selbst nicht mobil sind, d.h. es werden Moleküle zwischen den Clustern schnell ausgetauscht, mit einem Anteil von in Cluster eingebauten Molekülen und einem Anteil von frei diffundierenden Syntaxinen. Der Anteil der frei diffundierenden Moleküle (von den 90 Molekülen pro Cluster) wurde durch eine Simulation des FRAP Experimentes ermittelt. Bei der Simulation wurde angenommen, dass bei der Bildung von Clustern eine Balance aus Anziehungs- und Abstoßungskräften die Größe und Dynamik der Cluster bestimmt. Die Simulation hat ergeben, dass im Durchschnitt ca. 75 Moleküle pro Cluster aufkonzentriert sind. Zusammenfassend ergibt sich demnach ein Modell, nach dem sich Syntaxin-Cluster durch Selbstorganisation bilden und das zur generellen Diskussion der Mechanismen beiträgt, die bei der Membranproteinorganisation eine Rolle spielen. Ein zwei-Helix-SNARE-Komplex aus Syntaxin 1A und SNAP25 in lebenden Zellen Neben Syntaxin ist auch sein SNARE-Interaktionspartner SNAP25 in Clustern aufkonzentriert. Die Mobilität von SNAP25 nimmt allerdings nur geringfügig zu, wenn SNAP25 mit Deletionsmutanten verglichen wird, denen eines oder beide SNARE-Motive fehlen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die geringfügige Einschränkung der Diffusion von SNAP25 auf sein N-terminales SNARE-Motiv zurückzuführen ist, und zwar über einen Mechanismus, der eine Interaktion des N-terminalen SNARE-Motivs von SNAP25 mit Syntaxin 1 zur Grundlage hat. SNAP25 scheint sich also nicht über homophile Interaktionen in höher geordnete Cluster zu organisieren. Die Verlangsamung der Mobilität von SNAP25 über seine Interaktion mit Syntaxin wurde als Testsystem verwendet, um SNAP25-Komplexe mit Syntaxin in lebenden Zellen zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass in lebenden Zellen ein zwei-Helix-SNARE- Komplex gebildet wird, der aus dem SNARE-Motiv von Syntaxin und dem N-terminalen SNARE-Motiv von SNAP25 besteht. Dieser Komplex ist verschieden von Komplexen die man in Lösung beobachtet hat, wie zum Beispiel einem Komplex der aus zwei Molekülen von Syntaxin und einem SNAP25 besteht, wobei beide SNARE-Motive von SNAP25 involviert sind. Die Gründe dafür liegen wahrscheinlich zum einem in einem hohen Verhältnis von freiem SNAP25 zu freiem Syntaxin, das durch die Konzentration von Syntaxin in Clustern erreicht wird, und zum anderen in einem Mechanismus, der die Reaktivität des C- terminalen SNARE-Motivs im SNAP25 inhibiert. Weiterhin konnte aus den Daten und mikroskopischen Analysen der SNAP25 und Syntaxin-Cluster abgeleitet werden, dass sich die SNARE Komplexe an der Oberfläche von Syntaxin Clustern bilden. Demnach hat das SNARE-micropatterning einen wesentlichen Einfluss auf die Reaktivität von SNAREs und ist auch dafür entscheidend, welche der möglichen SNARE-Komplexe sich in lebenden Zellen bevorzugt bilden.
Publications
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(2006). The SNARE-motif is essential for the formation of syntaxin clusters in the plasma membrane. Biophys. J. 90, 2843-2851
Sieber, J.J., Willig, K.I., Heintzmann, R., Hell, S.W. and Lang, T.
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(2007). Anatomy and dynamics of a supramolecular membrane protein cluster. Science 317, 1072-1076
Sieber, J.J., Willig, K.I., Kutzner, C., Gerding-Reimers, C., Harke, B., Donnert, G., Rammner, B., Eggeling, C., Hell, S.W., Grubmüller, H. and Lang, T.
-
Structure and dynamics of a two-helix-SNARE-complex in live cells. Traffic
Halemani, N.D., Bethani, I., Rizzoli, S.O. and Lang, T.
