Untersuchungen zur Regulation der Enzymaktivität der Restriktionsendonuklease EcoRII durch Autoinhibition

• Applicant: Privatdozentin Dr. Monika Reuter
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 1997 to 2010
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 5393276

Die Wechselwirkung von Restriktionsendonukleasen mit spezifischen Nukleotidsequenzen setzt eine besonders hohe Präzision der Interaktion von Protein und DNA voraus. EcoRII ist der Prototyp einer besonderen Gruppe von Restriktionsendonukleasen, die nur dann das DNA-Substrat spalten, wenn zwei Kopien der EcoRII-Erkennungssequenz vorhanden sind, die gleichzeitig in einem aktiven DNA-Protein-Komplex gebunden werden. Wir haben in der monomeren EcoRII-Untereinheit zwei DNA-bindende Regionen identifiziert, die sehr wahrscheinlich gemeinsam den Substratbindungsort für einen EcoRII-Erkennungsort darstellen und gezeigt, daß es zur notwendigen funktionellen Wechselwirkung mit zwei Kopien des Erkennungsortes und zur schließlichen DNA-Spaltung der Dimerisierung von EcoRII bedarf. - Wir wollen nun prüfen, ob es sich bei den im EcoRII-Monomer nachgewiesenen Peptiden um ein Erkennungsmodul für C:G Basenpaare in verschiedenen Kombinationen handelt, das auch von anderen Restriktionsendonukleasen zur DNA-Erkennung genutzt wird. Dazu sollen durch "Cross-linking" von Restriktionsendonukleasen mit gleichen oder ähnlichen C:G-haltigen Erkennungssequenzen und ihren Substraten direkte Aminosäure-DNA-Kontakte analysiert werden. Mit der Peptid-Scan-Methode sollen Protein-Protein-Kontaktstellen im EcoRII-Dimer identifiziert werden, um ein Verständnis für die räumliche Nähe der für DNA-Bindung, Enzymdimerisierung und Katalyse verantwortlichen Regionen zu bekommen und ein Modell der Eco-RII-Domänenorganisation zu entwickeln.

• DFG Programme: Research Grants