Untersuchungen zur Regulation der Enzymaktivität der Restriktionsendonuklease EcoRII durch Autoinhibition
Final Report Abstract
Restriktions-und Modifikations-Systeme sind in Prokaryoten weit verbreitet und stellen einen wirksamen Schutz gegen das Eindringen mobiler genetischer Elemente dar. Sie kodieren für eine Restriktionsendonuklease (REase) und eine DNA-Methyltransferase (MTase) gleicher Sequenzspezifität. Die MTase methyliert die zelluläre DNA und schützt sie durch diesen epigenetischen Marker vor der Wirkung der REase. Die REase verhindert die Aufnahme fremder, unmethylierter DNA durch sequenzspezifische Spaltung. EcoRII ist eine REase, die für die effiziente DNA-Spaltung mindestens zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz benötigt. Untersuchungen der EcoRII-Struktur und -Funktion offenbarten, dass das Protein aus zwei stabilen Domänen aufgebaut ist. Im Ergebnis der Aufklärung der 3-D Struktur von EcoRII und der Tatsache, dass eine Verkürzung des Proteins, nämlich die Entfernung der N-terminalen Protein-Domäne, zu einer drastischen Verstärkung der Enzymaktivität führt, haben wir postuliert, dass EcoRII über einen Autoinhibitionsmechanismus – eine Art molekularen Schalter – reguliert wird. Verschiedene eukaryotische Signaltransduktionsproteine und Transkriptionsfaktoren zählen zu diesen sog. „Schalterproteinen“, für Restriktionsendonukleasen war diese Regulation aber bis dahin völlig unbekannt. Dabei vermuteten wir, dass die N-terminale Domäne wie ein Repressor die C-terminale Domäne sterisch blockiert und so deren katalytische Aktivität verhindert. Unser Ziel war es, das Autoinhibitionsmodell funktionell zu prüfen. Wir wollten die minimale Region der regulatorischen N-Domäne und die konkreten Aminosäuren lokalisieren, die zur Repression der Enzymaktivität notwendig sind. Wir konnten durch Nutzung unterschiedlicher experimenteller Ansätze die Regulation der EcoRII-Enzymaktivität durch Autoinhibition auf molekularer Ebene beweisen. Wir identifizierten β-Strang 1 (Aminosäuren 18-24) und α-Helix 2 (Aminosäuren 26-30) als essentielle inhibitorische Elemente der N-terminalen Domäne. Deletion einer dieser beiden nur kurzen Sekundärstrukturelemente verursachte eine vollständige Aufhebung der Autoinhibition. Darüber hinaus ist es uns gelungen, die 3D-Röntgenkristallstruktur des EcoRII Wildtyp-Enzyms mit 1.9 Ǻ zu lösen, die neue Erkenntnisse zur spezifischen DNA-Bindung des Enzyms und zur Position einer Mg2+- Bindungstasche lieferte. Über den Antrag hinausgehend haben wir sowohl biochemische Untersuchungen als auch Kristallisierungsversuche mit der EcoRII-MTase durchgeführt, die zu ersten diffraktierenden Kristallen des Enzyms in Anwesenheit der hemimethylierten DNA- Erkennungssequenz führten. Die experimentellen Kristallisierungsbedingungen der EcoRII MTase müssen optimiert werden, um zu besseren Kristallqualitäten und zur Aufklärung der 3D-Struktur des Ko-Kristalls zu führen.
Publications
- Mapping of the critical determinants for accomplishing autoinhibition of restriction endonuclease EcoRII enzyme activity. 3rd Annual Meeting of the Marie Curie Research Training Network “DNA Enzymes”, Berlin, Sept. 2008, p. 26
Szczepek, M., Mackeldanz, P., Möncke-Buchner, E., Krüger, D.H., Reuter, M.
- Mapping of the critical determinants of EcoRII autoinhibition. 19th European Students' Conference, Berlin, Sept./Oct. 2008
Szczepek, M., Mackeldanz, P., Möncke-Buchner, E., Krüger, D.H., Reuter, M.
- Structural studies of type IIE restriction endonuclease EcoRII-DNA complexes. American Crystallographic Association Meeting, Knoxville, USA, May/June 2008
Qiu, L., Szczepek, M., Reuter, M., Meehan, E.J., Chen, L.
- Molecular analysis of restriction endonuclease EcoRII from Escherichia coli reveals precise regulation of its enzymatic activity by autoinhibition. Mol. Microbiol. 72 (2009) 1011-1021
Szczepek, M., Mackeldanz, P., Möncke-Buchner, E., Alves, J., Krüger, D. H. and Reuter, M.
- New insights into the mechanism and structure of EcoRII endonuclease. 1st Joint BERII and BESSYII User Meeting, Helmholtz-Zentrum Berlin, November 2009
Szczepek, M., Spahn, C.M., Krüger, D.H., Reuter, M. and Scheerer, P.
- On the divalent metal ion dependence of DNA cleavage by restriction endonucleases of the EcoRI family. J. Mol. Biol. 393 (2009) 140-160
Pingoud, V., Wende, W., Friedhoff, P., Reuter, M., Alves, J., Jeltsch, A. Mones, L., Fuxreiter, M., and Pingoud, A.
- Crystal structure of EcoRII wild-type to 1.9 Å reveals a new Mg 2+ binding pocket and DNA minor groove interactions. 6th New England Biolabs Meeting on Restriction/modification, Jacobs University Bremen, 1st – 6th August 2010
Szczepek, M., Scheerer, P., Spahn, C.M., Krüger, D.H. and Reuter, M.
