Detoxifikation bei parasitischen Nematoden: Bildung und Transport von Glutathion-Konjugaten
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Aufklärung nematodenspezifischer Entgiftungsprozesse und deren selektive Inhibierung stellt einen Ansatzpunkt für Intervention bei Filarieninfektion dar. Ein Hauptmechanismus xenobiotischer/antioxidativer Abwehrsysteme basiert auf der Glutathion-Konjugation, katalysiert durch Glutathion S-Transferasen (GSTs). Die GSTs von Onchocerca volvulus, OvGSTI und OvGST2, konnten kristallisiert werden. Dies ermöglichte die Aufklärung ihrer SD-Struktur im Komplex mit dem natürlichen Substrat Glutathion als auch mit verschiedenen Inhibitoren. Bei der hochauflösenden Strukturanalyse der OuGSTI konnte eine sehr breite und offene Substratbindungstasche ermittelt werden, die mit der gefundenen Prostaglandin D2 Isomerase Aktivität übereinstimmt. Die Strukturanalyse ergab für die (M3ST2, dass besonders der Austausch der Aminosäure Arg 13 (humane pi-Klasse) mit Leu 13 (OvGST2) zu signifikanten Strukturänderungen führt. So entsteht eine wesentlich breitere Substratbindungsstelle, die zu einer anderen Substratspezifität führt und damit eine Basis für Inhibitorentwicklung bietet. Die zur Omega-Klasse gehörende OvGST3 ist durch oxidativen Stress stark induzierbar. Von ihr konnten insgesamt 14 Spieißvarianten isoliert werden. Obwohl die Expression einiger Spleißvarianten gelang, war es nicht möglich, für dieses sehr instabile Protein ein Substrat-Profil zu erstellen. Mittels Immunlokalisation konnte die OvGSTS ausschließlich in der Eihülle nachgewiesen werden. Die Untersuchung der lgG1- und lgG4-Antworten ergab, dass über 90% der Patientenseren die OvGST3 als Antigen erkannten. Im Vergleich zu den Kontrollseren konnte ein signifikanter Anstieg von lgG4 beobachtet werden, ein signifikanter Unterschied zwischen den lgG1- und lgG4-Reaktionen konnte jedoch nicht festgestellt werden. Eine Abhängigkeit der Immunantwort von der Mikrofilariendichte war signifikant. Desweiteren wurde eine GST der Omega-Klasse des Modellnematoden Caenorhabditis e/egans (CeGSTO-1) untersucht. Das dimere Enzym besitzt sowohl die für Omega-GSTs typische N-terminale Verlängerung als auch einen Cysteinrest (Cys-33) im aktiven Zentrum. Mittels Enzymtests konnte eine Thioltransferase-Aktivität und eine Dehydroascorbat-Reduktase-Aktivität ermittelt werden. Anhand Reportergen-Analysen wurde eine postembryonale Expression in den Darmzellen ermittelt. Der Minimalpromoter ist ca. 300 bp groß. Deletionsversuche und Mutagenese einer GATA-Box im 5'Bereich der cegsto-1 zeigte die direkte Beteiligung dieser Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle an der intestinalen Expression. Desweiteren konnte die essentielle Bedeutung des Transkriptionsfaktors ELT-2 an der basalen Expression nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Entgiftungsfunktion der CeGSTO-1 wurden transgene Würmer hergestellt, die die Omega-GST überexprimieren. Unter Einfluss oxidativer Stressoren überlebten dreimal so viele Überexpressionswürmer wie Kontrolltiere, was eindeutig zeigte, dass CeGSTO-1 eine erhöhte Resistenz vor oxidativem Stress vermittelt. Diese Ergebnisse wurden durch Versuche mit RNAi gestützt, wobei die RNAi-Würmer im Vergleich zu Kontrollwürmern eine stark erhöhte Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aulwiesen. Der eukaryotische Elongationsfaktor der Translation eEF-1y besitzt eine Domäne, die große Ähnlichkeit zur der GST-Klasse Theta aufweist. Daher wird vermutet, dass der Faktor eine interne Entgiftungsfunktion besitzt bzw. an Redoxprozessen beteiligt ist. Nach chromatographischer Aufreinigung des gesamten CeEF-1-Komplexes aus C. e/egans, konnte auch GST-Aktivität nachgewiesen werden. Im SDS-PAGE konnten die vier Proteine des Komplexes gezeigt und mittels Western-Blot und MALDI-TOF Analyse zwei Banden eindeutig als CeEF-1y und CeEF-1ß identifiziert werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Ayyadevara S, Engle, MR, Singh SP, Dandapat A, Lichti CF, Benes H, Shmookler Reis RJ, Liebau E, Zimniak, P (2005) Life span and stress resistance of Caenorhabditis elegans are increased by expression of glutathione transferases capable of metabolizing the lipid peroxidation product 4-hydroxynonenal. Aging Cell 4:257-71.
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Höppner J, Perbandt M, Betzel C, Walter RD, Liebau E (2004) Crystallization of the major cytosolic glutathione S-transferase from Onchocerca volvulus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:1496-1497.
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Perbandt M, Höppner J, Betzel C, Walter RD, Liebau E (2005) Structure of the major cytosolic glutathione S-transferase from the parasitic nematode Onchocerca volvulus. J Biol Chem 280:12630-12636.
