Entwicklung eines Verfahrens zur molekularen Evolution parabolischer Replikatoren durch Reaktivchromatographie von Oligonukleotidbibliotheken
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Oligomerisierung komplexer Reaktionssysteme genauer zu untersuchen. Als Bausteine der offenen Replikationssysteme wurden 5'-Amino-3'-phosphat Di- und Trinukleotide verwendet, die in situ durch EDC aktiviert werden. Ausgehend von dimeren und tetrameren Bausteinen wurden lange Oligonucleotidketten erhalten. Komplementäre Kettensequenzen spielen offensichtlich die Schlüsselrolle im Wachstum der Oligomeren. Die Produktbildung wurde hinsichtlich Kinetik, Sequenzlänge sowie sich möglicherweise preferenziell bildender Sequenzmotive analysiert. Komplementäre Ketten von nCAp und von nTGp führten zu Mischsequenzen mit bis zu 300 Basen. Äquimolare Mischungen von zweibasigen Bausteinen nXYp, in dem X für eine Pyrimidin- und Y für eine Purinbase steht ergeben Ketten gemischter Sequenzen mit bis zu 70 Basenpaaren. Maximale Kettenlänge wird normalerweise bereits nach 24 Stunden erreicht (die Reaktion ist langsamer für die Bausteine mit Thymin an den 5'-Enden), danach erfolgt Umverteilung zu größeren Molekulargewichten. In den Fällen, wo die Reaktion nur zwischen vollkommenen Duplices auftreten kann, wie bei den Tetrameren von nCATGp und nTGCAp, wird die maximale Länge auf 70-80 Basenpaare begrenzt. In den Fällen von Slidomeren (Bildung hochmolekularer hybridisierter Aggregate der jeweiligen Oligomere (von 'to slide' - rutschen, verschieben)), wie sie z.B. in Sequenzen von gerade einem selbstkomplementären Baustein wie nTAp oder nCGp gebildet werden, variiert die Länge der Produkte zwischen 80 und 150 Basenpaaren. Die equimolaren Mischungen von zwei nicht komplementären Bausteinen, in denen die Reaktion zwischen Einzelsträngen stattfinden kann, sind gerade noch in der Lage kurze Ketten mit bis zu 50 Basenpaaren zu bilden. Längere Ketten werden gebildet in den Fällen, wo mindestens 2 unterschiedliche Reaktionen möglich sind - die Reaktion zwischen stabilen Duplices und die zwischen zwei Ketten mit Dimeren-Überhängen. Solches sind die Mischungen von nCAp und nTGp, nTGCAp mit nCAp und nTGp und mit den drei Bausteinen nCGp, nCAp und nTGp. In all diesen Fällen werden Oligomere von 150 bis <300 Basenpaare gebildet. Für die Entwicklung von konkurrierenden selbstreplizierenden Minimalsystemen wurden das Design, die Synthese und die Charakterisierung der Komponenten des Systems aufgeführt. Wegen der totalen Strukturähnlichkeit von pCGG- und CGGp-Trinukleotiden konnten durch Einführung unterschiedlicher Schutzgruppen am unreaktiven Ende der Trioligonucleotide Schwierigkeiten der Produktcharakterisierung überwunden werden. Dieses erlaubte zusätzlich vollkommene HPLC-Trennung der Reaktanden und der Reaktionsprodukte. Die frühere Methode der kinetischen Messungen wurde verändert und vereinfacht. Sie erlaubt dadurch höhere Reproduzierbarkeit der Resultate. Jedes System wird separat charakterisiert und vorbereitet, um Selektionsexperimente durchzuführen.
