Functional characterisation of a gene family encoding circadian regulated glycine-rich RNA-binding proteins in Arabidopsis thaliana
Plant Biochemistry and Biophysics
Final Report Abstract
In der zweiten Förderperiode haben wir verschiedene Mechanismen der posttranskriptionellen Regulation aufgeklärt, über die AtGRP7 (Arabidopsis thaliana glycine-rich RNA-binding protein 7) seine target Gene reguliert. AtGRP7 beeinflusst andere circadian regulierte Transkripte in Abhängigkeit von der Phase des circadianen Zyklus. Das steht im Einklang mit seiner angenommenen Funktion als „slave Oszillator“. Mittels mathematischer Modellierung konnten wir zeigen, dass die negative Autoregulation und reziproke Kreuzregulation von At- GRP7 und seinem Paralog AtGRP8 durch alternatives Spleißen und Nonsense-mediated decay für die Form der Transkriptoszillationen notwendig ist. AtGRP7 hat auch einen globalen Effekt auf alternatives Spleißen. Unter anderem reguliert es das alternative Spleißen von Transkripten, die für andere RNA-Bindeproteine codieren. Das weist auf eine hierarchische Organisation der posttranskriptionellen Kontrolle in der Zelle hin. Um direkte targets von At-GRP7 zu identifizieren, haben wir RNA Immunpräzipitation von epitop-markierten RNA-Bindeproteinen aus Pflanzenextrakten etabliert. Einige der Transkripte, deren alternatives Spleißen von AtGRP7 reguliert wird, werden in vivo von AtGRP7gebunden. Damit ist At-GRP7 das erste hnRNP-ähnliche Protein in Pflanzen, für das eine Regulation von alternativem Spleißen durch direkte Bindung an target Transkripte nachgewiesen wurde. Wir zeigen außerdem, dass AtGRP7 die Expression von Kupfer-Zink-Dismutasen über einen Mechanismus reguliert, der microRNA398 involviert. In AtGRP7-ox Pflanzen korreliert ein reduziertes Niveau an miR398 mit einem erhöhten Niveau an dem Vorläufer. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass AtGRP7 in vivo an den Vorläufer der miR398 bindet. Außerdem fanden wir eine Kolokalisation mit anderen Prozessierungskomponenten im Kern und in „dicing bodies“. Damit haben wir AtGRP7 als eine bisher unbekannte Komponente der miRNA Biogenese identifiziert und konnten zeigen, dass es die Prozessierung von Vorläufern durch direkte in vivo Bindung beeinflusst. AtGRP7-ox Pflanzen zeigen eine erhöhte Immunität gegenüber Pseudomonas syringae. AtGRP7 beieinflusst Transkripte der Salizylsäure-abhängigen Verteidigung und der Jasmonsäure/Ethylen-abhängigen Verteidigung differentiell. AtGRP7 aktiviert die Expression von PR Genen über einen indirekten Mechanismus, der abhängig von NPR1 ist und die transkriptionelle Aktivierung des PR-1 Promotors involviert. Dagegen bindet At- GRP7 in vivo an die PDF1.2 mRNA und hat keinen Einfluss auf dessen Promotoraktivität, was auf eine direkte posttranskriptionelle Kontrolle schließen lässt. Außerdem zeigen wir dass AtGRP7 den Blühzeitpunkt der Pflanze über verschiedene Signalwege beeinflusst und identifizieren target Gene der Blühzeitpunktkontrolle.
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